复合侵染甘蔗的病原病毒RT-PCR检测

根据甘蔗花叶病毒（sugarcane mosaic virus,SCMV）、高粱花叶病毒（sorghum mosaic virus,SrMV）和甘蔗黄叶病毒（sugarcane yellow leaf virus,SCYLV）外壳蛋白（CP）基因序列分别设计合成3对特异引物SCMV–F/R、SrMV-F/R和SCYLV-F/R,以表现花叶和黄叶复合症状的甘蔗叶片总RNA为模板,分别进行3种病毒单一RT-PCR检测,在SrMV和SCYLV特异引物RT-PCR反应体系中分别扩增到约850 bp和630 bp特异性片段。序列测定及同源性比对结果显示,850 bp片段测序所得序列与浙江象山、临平和余杭SrMV分离物（GenBank登录号分别为AJ310194、AJ310195和AJ310198）对应序列同源性95%,630 bp片段测序所得序列与广东、广西、福建SCYLV分离物（GenBank登录号分别为GU190165、GU190162、GU190159）对应序列同源性99%,表明该样品同时感染SrMV和SCYLV。在此基础上建立同时检测SrMV和SCYLV的一步双重RT-PCR体系,可检测10-6 g病叶组织中的病毒,田间样品检测效果良好。     

干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库构建及EST序列分析

[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95%,文库插入片段长度在500~2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5%和93.5%.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87%;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13%.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因.     

土壤自然干旱胁迫对甘蔗幼苗根系保护酶系统的影响

[目的]研究干旱胁迫对甘蔗苗期根系保护酶系统及相关指标的影响,探讨甘蔗苗期根系对干旱胁迫的应答机制.[方法]以新台糖22号为材料,在甘蔗苗期进行土壤自然干旱胁迫,测定甘蔗根系保护酶系统及质膜过氧化产物相关指标的变化,并进行相关性分析.[结果]随着干旱胁迫程度的加强,根系中可溶性蛋白质、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量逐渐增加,细胞膜脂过氧化保护酶系统的酶活性均呈先升后降的趋势,干旱胁迫处理15 d后SOD和POD活性达到峰值然后降低,CAT活性于11d到达峰值后下降.甘蔗苗期根系保护酶活性与膜脂过氧化作用呈显著或极显著正相关.[结论]甘蔗根系保护酶系统的干旱胁迫响应机制为:轻度干旱与中度干旱时表现为积极应对,重度干旱时则为被动忍耐.根系保护酶系统与甘蔗抗旱性的关系密切.     

甘蔗乙烯受体基因Sc-ERS的克隆与序列分析

根据已知乙烯受体基因的序列信息,设计1对简并引物和1对特异引物,对甘蔗叶片基因组DNA进行PCR扩增,获得1个甘蔗乙烯受体基因（Sc-ERS）的片段,其大小为4310 bp,包含1个由5个外显子和4个内含子组成的4219 bp大小的完整编码区。Sc-ERS编码区与玉米乙烯受体ERS1基因（AY359578）、水稻乙烯受体ERS1基因（AY043031）编码区的同源性分别为91.4%、61.6%;推导Sc-ERS编码的蛋白包含636个氨基酸残基,与玉米、水稻乙烯受体基因所编码蛋白的氨基酸同源性分别为94.1%、89.4%。其推导蛋白结构分析结果显示,Sc-ERS编码的蛋白和玉米、水稻ERS1所编码的蛋白相同,在N段保守区含有3个跨膜结构,并由3个跨膜结构、GAF结构、HisKA和HATPase_c组成功能域。核苷酸序列分析和蛋白质结构分析结果表明,Sc-ERS基因属于ERS1基因。     

甘蔗ATP结合蛋白基因克隆及其干旱胁迫下的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗ATP结合蛋白基因,分析其基本生物学信息及在干旱胁迫下的表达特性,为ATP结合蛋白的功能研究提供理论依据.[方法]从乙烯诱导甘蔗差异表达转录组和水分胁迫下甘蔗cDNA文库中获取ATP结合蛋白基因序列,设计其引物进行RT-PCR扩增,利用生物信息学软件进行序列分析及其蛋白结构和功能预测,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测干旱胁迫处理下的甘蔗ATP结合蛋白基因的表达情况.[结果]克隆获得的甘蔗ATP结合蛋白基因全长2145bp,编码714个氨基酸,其蛋白分子质量为79.430kD,理论等电点(pI)为9.33,不稳定系数为44.38;甘蔗ATP结合蛋白与玉米ATP结合蛋白的核苷酸序列及其推导氨基酸系列同源性最高,均达93%.甘蔗ATP结合蛋白主要由无规则卷曲(42.02%)、α螺旋(25.63%)和延伸链(22.27%)结构组成,具有蛋白激酶催化结构域、ATP结合位点、核苷酸结合位点(NBS)、糖基化位点、激酶磷酸化结合位点及核定位信号等;甘蔗ATP结合蛋白可能主要定位在细胞核、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体中,起中间代谢调控作用,或参与转录调控、免疫应答、胁迫应答及信号转导等生物反应.qPCR检测结果显示,在干旱胁迫7d后,甘蔗ATP结合蛋白基因的表达量明显下调,约为对照的30%,恢复正常供水(复水)后,表达量回升.[结论]甘蔗ATP结合蛋白基因表达受干旱胁迫诱导,可能参与甘蔗对干旱逆境胁迫响应的代谢调控.     

甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPS Ⅲ基因表达分析

为探讨蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,简称SPS)对甘蔗糖分代谢的重要影响,以4个甘蔗品种桂糖28号(GT28)、果蔗Badila、新台糖20号(ROC20)、新台糖22号的+1、0叶(最高可见肥厚带的第1张完全展开叶为+1叶,自下而上位于+1叶之上的为0叶)、幼嫩叶鞘、幼茎等部位为材料,采用半定量RT-PCR技术分析甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因(简称SPSⅢ)在工艺成熟期不同部位中的表达情况。结果表明,在工艺成熟期间,SPSⅢ在4个甘蔗基因型的+1、0叶、幼嫩叶鞘和幼茎中均有表达,表达量因基因型及测定部位与时期不同而不同;在工艺成熟初期,以GT28的4个部位较其他3个品种的低,而在果蔗Badila的4个部位中表达较稳定,在ROC20中以嫩叶鞘表达最高,而在ROC22中以幼茎表达最高,在工艺成熟中期,SPSⅢ在4个甘蔗基因型中的+1、0叶、幼嫩叶鞘和幼茎中的表达较初期没有明显差异;在工艺成熟后期,SPSⅢ在4个甘蔗基因型中的+1、0叶、幼嫩叶鞘和幼茎中的表达较前2个时期迅速提高,均达到了较高的表达水平。     

普通野生稻稻褐飞虱抗性在水稻改良中的利用研究

本文报道了普通野生稻稻褐飞虱抗源的杂交利用技术及其获得的一大批抗性创新种质和育种品系。研究了杂交后代性状分离、不同杂交方式、抗性鉴定时期和花药培养的抗性育种效果，证明了复交和回交方式、花药培养获得纯合体、以及早期(F2)抗性鉴定是在育种上利用的关键技术措施。本项目还配制了大量(293个)杂交组合，进行稻褐飞虱抗性创新品系的选育工作，对选育出的493个遗传稳定品系进行抗性鉴定、运用RAPD标记对筛选出的143份抗性育种品系进行分子标记多态性分析，从中首次获得了一大批(120份)具有DNA分子标记多态性(遗传多样性)的抗性创新种质，为今后培育抗性品种打下基础。研究还初步培育出5个具有生产应用价值的高产(或优质)抗稻褐飞虱育种品系和杂交稻组合。     

干旱胁迫下割手密基因cDNA-SCoT差异表达分析（英文）

【目的】通过分析割手密叶片在干旱胁迫下的基因表达谱,筛选获得抗旱相关基因,为开展甘蔗抗旱性遗传改良研究提供候选基因。【方法】以割手密GX83-10为材料,构建正常浇灌(对照)及两个干旱处理叶片总RNA混合池,使用cDNA-SCoT构建割手密GX83-10伸长期应答干旱胁迫的基因表达谱,筛选、分离转录衍生片段(TDFs)并进行测序,根据NCBI数据库BLAST同源性检索结果推测基因功能,并使用qRT-PCR对抗旱相关TDFs进行表达验证分析。【结果】成功获得120个上调表达TDFs序列,其中53个TDFs序列与NCBI数据库中已录入的基因具有较高相似性,根据同源基因功能可分为10个类群:结合功能蛋白相关基因(20.75%)、新陈代谢相关基因(13.21%)、通信及信号转导相关基因(13.21%)、转录调控因子相关基因(13.21%)、运输途径相关基因(11.32%)、环境互作相关基因(9.43%)、能量代谢相关基因(7.55%)、蛋白质合成相关基因(3.77%)、防御相关基因(3.77%)及细胞成分生物合成相关基因(3.77%)。通过对运输因子家族蛋白、RING/U-box超家族蛋白、22 kD干旱诱导蛋白、微管蛋白alpha-3链和质膜H+-ATPase进行qRT-PCR分析,结果表明,这些基因在干旱胁迫下均呈不同程度的上调表达。【结论】干旱胁迫下,应用cDNA-SCoT构建割手密叶片基因表达谱筛选抗旱相关基因具有可行性。从割手密叶片中挖掘获得的抗旱及水分有效利用相关基因,可为利用野生种质资源开展甘蔗育种研究提供候选基因,改良甘蔗抗旱性,拓宽甘蔗育种基因库。     

杀虫基因高效植物表达载体的构建

以质粒pCAMBIA1200、pBI121、pMMAR和pC1300MAR为基础,通过酶切连接,构建植物中间载体pC2MARHyg;再利用pAVAc质粒、载体pGA1611和中间载体pC2MARHyg,构建含有Ubi-1启动子、顺向重复MAR和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR-AVAc,然后转化农杆菌EHA105,经筛选鉴定获得阳性克隆,为进一步开展植物抗虫基因工程研究奠定基础。     

生物技术开放实验室管理经验探讨

广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室是广西农业生物技术研究的重要基地,实验室长期坚持高度开放的管理模式,通过建立规范的管理制度、做好仪器使用技术及安全知识培训、合理的仪器配置与规范化管理、与有关单位共建科研基地、加强人才管理队伍建设及鼓励和促进科技人员充分利用实验室的研究平台开展高水平的研究工作等方面的管理措施,经过几年的发展与完善,基本形成了一个长效制度,使开放实验室实现安全、高效运行,并取得了良性发展。