GH-DREB基因转化小麦及转基因植株后代的抗旱生理指标鉴定

用基因枪法将来自于棉花的DREB转录因子基因和诱导型启动子Rd29A构建的植物表达载体pRdGH转入小麦品种鲁麦22号,获得转基因小麦植株。T0、T1、T2、T3代分子生物学鉴定证实：GH-DREB基因可以稳定遗传。孕穗期到开花期T3代叶片可溶性糖、蒸腾速率、净光合速率测定结果表明：正常条件下,转基因后代与受体鲁麦22的各生理指标无明显差异,而水分胁迫下,转基因后代的净光合速率随着干旱处理时间的延长而逐渐下降,蒸腾速率随着干旱处理时间的延长而逐渐上升,但是,下降与上升幅度比对照低,其中,在胁迫第3天、第6天都与对照差异极显著,叶片的可溶性糖含量与对照相比差异不显著。说明GH-DREB基因在干旱条件下可通过减少蒸腾速率、维持光合作用。     

小麦转TaEBP基因株系抗旱特性分析

以2个转TaEBP基因新春9号小麦株系(G9-X1129,G9-X1139)、受体品种新春9号和当地推广品种小偃22为材料,通过PEG-6000人工模拟干旱胁迫处理,调查小麦种子萌发期胚芽鞘、胚根长度和胚根数;采用大田不同水分处理试验,测定转基因小麦不同生育时期的生理生化、形态指标与抗旱指数,以明确其抗旱性。结果表明:(1)在种子萌发期20%(W/V)PEG干旱胁迫条件下,参试材料的胚芽鞘长度、胚根长度和胚根数均比非胁迫时降低,G9-X1129和G9-X1139的降幅较小且均显著高于受体对照新春9号;(2)与受体对照新春9号相比,G9-X1129和G9-X1139具有较高的可溶性蛋白含量和脯氨酸含量;(3)随着干旱胁迫程度的增强参试材料的株高、穗叶距和穗长均有不同程度的降低,但转基因株系株高、穗叶距和穗长降幅显著小于受体对照;(4)G9-X1129和G9-X1139分别比受体对照新春9号增产11.67%和10.19%,其抗旱指数分别为1.18和1.17,两者都属较强抗旱等级,表现出比新春9号更强的抗旱、节水性能;整体上G9-X1129和G9-X1139与小偃22具相对一致的抗旱能力。     

谷子转录因子SiNAC18通过ABA信号途径正向调控干旱条件下的种子萌发

【目的】谷子(Setaria italica L.)具有显著耐旱性。研究旨在通过反向遗传学方法分析并鉴定在干旱条件下影响植物萌发过程的重要调控因子,为研究作物干旱条件下种子萌发的调控机制创造条件。【方法】使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05软件对谷子SiNAC18蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建系统进化树;利用real-time PCR方法检测SiNAC18在不同胁迫条件下的表达模式;通过瞬时转化的方法分析SiNAC18蛋白亚细胞定位;在拟南芥中过表达SiNAC18,分析SiNAC18的生物学功能;分析SiNAC18在转基因拟南芥中可能控制的下游基因。【结果】SiNAC18全长1 074 bp,编码由357个氨基酸组成的亲水性蛋白,分子量约为38.8 k D;系统进化树分析表明SiNAC18属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组,与拟南芥基因At NAC29同源性最高;氨基酸序列比对结果显示,SiNAC18与其他物种包括水稻、拟南芥、大豆和玉米中同源性最高的NAC类转录因子蛋白的N端都具有A、B、C、D和E这5个保守结构域,蛋白C端具有高度多态性,证明SiNAC18的N端序列与其结合下游基因启动子元件相关;real-time PCR结果显示,SiNAC18在干旱(PEG)、ABA、高盐(Na Cl)及过氧化氢(H2O2)处理条件下的表达量明显上升;亚细胞定位结果表明SiNAC18蛋白定位于细胞核中;基因功能分析结果显示,在ABA和PEG胁迫处理下,SiNAC18转基因拟南芥与野生型种子的萌发率存在明显差异:在正常生长条件下,野生型拟南芥WT和SiNAC18转基因拟南芥的萌发率基本一致,在PEG浓度为10%和15%的MS培养基上,SiNAC18转基因拟南芥的萌发率显著高于WT。在2和5μmol·L-1 ABA处理条件下,转基因拟南芥的萌发率显著低于WT;下游基因表达分析结果显示,ABA信号途径相关基因At RD29A,脯氨酸合成相关基因At P5CR和At PRODH以及过氧化物酶基因At PRX34在SiNAC18转基因株系中的表达量高于WT中的表达量,表明SiNAC18通过调控这些下游基因影响转基因植物在干旱条件下的萌发率。【结论】谷子NAC类转录因子基因SiNAC18可能通过ABA信号途径、氧化胁迫调控等途径正向调控植物在干旱条件下的萌发过程。     

两个转W23基因小麦株系的抗旱性鉴定

以两个T₅代转W23基因小麦株系G19-X59、G19-X61为材料,在水培条件下采用PEG-6000人工模拟干旱胁迫措施对转基因小麦株系的根系发育特点、抗旱相关的光合生理等指标进行了测定。结果表明,干旱胁迫条件下各参试小麦的光合速率(Pn)和蒸腾速率(Tr)均下降,转基因株系降幅较小,且其Pn和Tr值极显著高于受体品种;在正常供水和干旱胁迫两种水分处理下,转基因株系均比受体品种具有较发达的根系,其根总长、根总表面积、根总体积等参数极显著高于受体品种。这一结果说明,转W23基因小麦株系G19-X59、G19-X61在苗期依靠发达的根系维持较强的光合作用,提高其应对干旱胁迫的能力。     

小麦热激蛋白WHSP90基因的原核表达及多克隆抗体制备

为了进一步研究HSP90基因的功能,将WHSP90基因构建到原核表达载体pET-28a(+)中,得到His-WHSP90融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,发现1 mmol/L IPTG诱导4 h蛋白表达量最大;经过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)纯化得到的纯化蛋白浓度达到0.4 mg/mL.免疫家兔制备抗体,用间接ELISA法检测免疫后家兔抗血清效价大于125 000,满足后续试验要求的效价值,为在蛋白水平上研究WHSP90基因功能提供了基础.     

小麦新品系YW243条锈病抗性鉴定

YW243是通过多种抗源复合杂交、花药培养选育的普通小麦新品系,经多年田间和室内条锈病生理小种接种鉴定表明,YW243在苗期和成株期均高抗国内现流行的条中29号、条中30号、条中31号、SU－11、条中32号等多种生理小种;与感病品种京771测交后代遗传分析证明该品系含有1对显性抗条锈病基因。     

大豆转录因子基因GmNF-YCa可提高转基因拟南芥渗透胁迫的耐性

植物的核因子Y(NF-Y)是由3个亚基A、B和C组成,在响应非生物胁迫过程中起着重要的作用。本研究以大豆铁丰8号为材料,建立大豆c DNA文库,以p GBKT7-Gm Di19-5为诱饵,通过酵母双杂交技术筛选大豆c DNA文库,获得了大豆NF-Y转录因子家族亚基C的一个成员,命名为GmNF-YCa。该基因全长为864 bp,编码287个氨基酸,属于NF-YC亚家族。GmNF-YCa分子量为31.6 k D,等电点为5.07亲水性蛋白,具有一个跨膜结构域,无信号肽。序列分析表明,NF-YC亚家族具有很高的保守性。GmNF-YCa基因启动子含有ARE、Box4、GATA-motif、Box I、ACE、ABRE和CAT-Box等胁迫和光响应元件。组织特异性分析表明,GmNF-YCa基因在种子萌发期表达量最高。实时定量结果表明,GmNF-YCa受蔗糖和甘露醇的诱导上调表达。使用农杆菌介导法,将大豆GmNF-YCa基因导入拟南芥,并进行了功能分析。发芽率试验分析表明,GmNF-YCa的转基因提高了转基因拟南芥萌发期对渗透胁迫的耐性;改良了在蔗糖和甘露醇处理下转基因拟南芥的根系生长和侧根发育。     

转复制酶基因抗小麦黄花叶病新品系的评价与利用

研究抗黄花叶病毒病转基因小麦新品系的利用价值,对小麦黄花叶病抗性遗传稳定性、农艺性状、主要品质特性和其他主要病害抗病性进行鉴定.结果表明:抗黄花叶病毒病转基因小麦新品系N12、N13、N14和N15抗性稳定,具有分蘖力强、成穗率高及穗粒数多、品质好等优点,可作为优异种质资源利用.通过回交育种技术,成功地将抗黄花叶病毒病基因转入到当地推广品种或中间材料中,已育成的1个兼抗黄花叶病和白粉病新品系04T19,以及聚合Wax基因、Pm基因与抗黄花叶病毒病转基因的材料6株,在丰产性、抗病性等方面均较N12、N13、N14和N15有较大提高.     

盐响应信号途径SOS与植物K+吸收关系

【目的】在盐胁迫条件下研究SOS突变体K+吸收的变化,旨在解析植物高盐胁迫响应与K+吸收的关系。【方法】以SOS信号途径的3个主要基因sos1、sos2、sos3突变体和野生型拟南芥（WT）为试验材料,在含有不同Na+/K+浓度比例的培养基上处理试验材料,观察各突变体与WT的表型差异,进行根系扫描、测定植物的RGR（相对生长率）,植株体内Na+、K+的含量,计算植株体内Na+/K+浓度比值,同时,利用qRT-PCR分析K+转运体基因AKT1、AKT2、SKOR在突变体和WT间的表达差异。【结果】不同浓度K+进行处理时,突变体和WT之间没有明显差异;在30 mmol•L-1 NaCl处理下,植株形态、RGR和体内Na+/K+浓度比值,体内K+浓度的测定结果显示,当K+浓度从0.2 mmol•L-1 增加到60 mmol•L-1 时,K+浓度增加缓解了高盐胁迫对突变体生长的抑制作用。所有植株体内的Na+/K+值降低,体内K+浓度提高。在相同处理条件下,突变体的Na+/K+值高于WT,WT体内K+浓度高于突变体;当K+浓度升高到80 mmol•L-1 时,突变体的生长又重新受到抑制。所有植株体内的Na+/K+值升高,体内K+浓度降低。3个K+转运体AKT1、AKT2、SKOR的real-time PCR分析结果显示,在30 mmol•L-1 NaCl处理时,在低钾条件下（0.2 mmol•L-1 K+）AKT1和SKOR表达比较低,而高钾条件下（20.05 mmol•L-1 K+或者60 mmol•L-1 K+）AKT1、AKT2、SKOR的表达量没有明显差异,这3个基因的表达方式在突变体之间没有明显的差异。【结论】在中度盐胁迫条件下,外界K+浓度增加可以缓解盐胁迫对植物生长造成的抑制作用,但是当外界一价阳离子的总浓度高于110 mmol•L-1时,拟南芥的生长重新受到抑制。SOS信号途径对植物K+吸收没有直接的调节作用。     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。