五种玉米病毒多重PCR检测体系的建立

玉米在我国农业生产中占据重要地位,而病毒病的长期发生严重威胁我国玉米产业.随着病毒鉴定技术的发展,目前已报道侵染我国玉米的病毒有12种之多(张超等,2017).病毒检测是病害防控中的重要环节,但田间玉米病毒种类的多样性及其复合侵染的普遍性增加了鉴定难度.为加强对玉米病毒的及时监测,本研究拟针对甘蔗花叶病毒(sugar-...     

重庆地区侵染抱子芥和茎瘤芥的病毒及其株系的分子鉴定

为了明确当前重庆地区抱子芥和茎瘤芥病毒病的病原种类和株系,在重庆13个区县的18个乡镇采集疑似病毒感染的样品进行病毒RT-PCR检测和株系分析。结果表明:在57份抱子芥样品中,黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)和芸薹黄化病毒(Brassica yellows virus,BrYV)的检出率分别为31.58%、85.86%、49.12%、59.65%和77.19%,其中87.72%的样品受两种及以上病毒的复合侵染,45.61%的样品受3种病毒的复合侵染;在41份茎瘤芥样品中,CMV、TuMV、PVX和BrYV的检出率分别为36.59%、73.17%、75.61%和70.73%,其中80.49%的样品受两种及以上病毒的复合侵染,51.22%的样品受3种病毒的复合侵染。对各检出病毒分离物CP基因进行扩增、序列测定和系统发育分析,明确抱子芥和茎瘤芥中TuMV分离物归属于TuMV的World-B组;CMV分离物归属于CMV亚组Ⅰ;PVX分离物归属于PVX的X3株系;BrYV和TMV与已报道的病毒株系CP基因核苷酸序列具有很高的相似性,存在一定的地域相关性,BrYV为重庆地区首次报道。     

温州蜜柑萎缩病毒小外壳蛋白基因克隆与原核表达及其抗体制备

 用RT-PCR方法,从采自重庆奉节的‘宫本’柑橘的2个样品中扩增出温州蜜柑萎缩病毒（Satsuma dwarf virus,SDV）SDV RNA2的3′末端,长度为975 bp,与报道的SDV S-58 3′末端序列同源性分别为98.7%和98.4%。根据获得的序列设计引物,以含有SDV FJ 3′末端序列的质粒为模板,PCR扩增获得大小为 654 bp的SDV-FJ小外壳蛋白（Small coat protein,CPS）基因产物。构建了CPS与GST融合表达载体PGEX-CPS,在37 ℃、1.0 mmol · L-1 IPTG条件下诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明成功表达出分子量约为42 kD的GST-CP融合蛋白。以表达的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备的抗血清的效价为1/12 800。用获得的抗体进行组织印迹分析表明,SDV在柑橘叶柄基部韧皮部维管束区域含量最高。     

重庆辣椒上番茄斑萎病毒的血清学检测及分子鉴定

为明确重庆地区辣椒上番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的发生情况及其外壳蛋白基因(cp)序列变异特征,采用斑点免疫杂交法(Dot-ELISA)和反转录PCR(RT-PCR)技术对采自重庆的298份辣椒病毒病样品进行了检测和分子鉴定。Dot-ELISA检测结果表明,有40份辣椒样品检测到TSWV,检出率为13.42%。通过电子显微镜在TSWV检测呈阳性的样品中观察到具包膜的球状病毒粒体。设计扩增TSWV cp的引物,选取6个TSWV阳性样品进行RT-PCR扩增,均扩增到大小约750 bp的目的片段。序列分析表明,重庆辣椒分离物TSWV-CQ(KX611497)与已报道的22个TSWV分离物cp基因的核苷酸相似性为96.1%~99.4%,与已报道的TSWV中国分离物亲缘关系较近,表现出明显的地理相关性。     

四川番茄黄化曲叶病病原分子鉴定及变异分析

 【目的】明确引起四川番茄黄化曲叶病（Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD）的病原。【方法】对采自四川攀枝花市田间表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄植株SC64-67,通过PCR、克隆及测序等技术获得病毒及卫星DNA的全基因组序列,并对序列进行变异分析。【结果】利用双生病毒简并引物PA/PB从4个样品中均扩增得到约500 bp的片段,随机选择SC65进行DNA-A全基因组扩增和序列测定,该DNA分子全长为2 732 nts,系统进化分析表明,其与已报道的中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV）来自云南元谋的菜豆分离物（TYLCCNV-Bean-YM）的核苷酸序列相似性最高,为96.0%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNAβ分子。全序列测定表明SC65 DNAβ全长1 338 nts,与分离自云南楚雄番茄上的TYLCCNV-Y25伴随的卫星DNAβ亲缘关系最近,核苷酸序列相似性为77.5%。【结论】研究表明四川番茄黄化曲叶病样品均受到TYLCCNV/DNAβ病害复合体的侵染,但其病毒DNA-A和卫星DNAβ分子来源于TYLCCNV的不同分离物。     

普通烟草铁氧还蛋白Ⅰ的原核表达、抗体制备及在ToMV侵染烟草体内表达分析

【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-Ⅰ)原核表达载体,表达可溶性Fdn-Ⅰ蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-Ⅰ在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-Ⅰ全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-Ⅰ,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-Ⅰ与GST融合表达载体pEGX-Fdn-Ⅰ,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-Ⅰ可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-Ⅰ蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-Ⅰ的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3mmol·L-1条件下表达出大小为41.3kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-Ⅰ的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-Ⅰ在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-Ⅰ大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-Ⅰ的表达。     

温度对二点叶蝉的发育存活及繁殖的影响

在15℃,20℃,25℃,28℃,32℃,35℃恒温条件下,研究温度对二点叶蝉发育、存活和繁殖的影响。拟合二点叶蝉发育速率与温度之间的关系模型,求出各发育阶段的发育起点温度和发育上限、下限温度,组建不同温度下实验种群特定时间生命表,计算种群增长参数,分析种群增长参数与温度之间的关系。结果表明,在15℃下,卵不能完成发育,在35℃条件下3龄若虫不能存活。二点叶蝉种群增长最适温区为25—32℃。在该温区范围内,内禀生殖力为0．0631-0．0463。周限增长率为1．0561—1．0497,种群存活曲线属于DeeveyⅠ型,而在15℃不利条件下,种群存活曲线属于DeeveyⅢ型。     

重庆市萝卜芜菁花叶病毒的检测与序列分析

为明确重庆市萝卜感染芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的情况,在重庆市巴南区、九龙坡区、北碚区等14个区县共采集了146份萝卜病毒病样品,采用酶联免疫吸附试验法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)对病样进行TuMV检测,并通过PCR、克隆和测序等技术获得13个TuMV分离物CP核苷酸序列,利用软件分析重庆市TuMV CP基因序列的相似性,利用系统进化树分析CP基因遗传变异与系统进化。结果表明,共有105份样品的TuMV检测为阳性,检出率为71.9%;所得13个分离物CP基因均为864 bp,测序的13个分离物CP核苷酸相似性为89.1%~99.2%,与国内已报道的TuMV各分离物CP核苷酸相似性在88.3%~99.4%之间;所得的13个分离物均分布在basal-BR和world-B组中,在Asian-BR和basal-B组中均无分布,进一步分析发现有9个分离物属于word-B组,仅4个分离物属于basal-BR组。研究表明,TuMV在重庆市萝卜各种植区普遍发生,且word-B组为重庆市萝卜的优势毒源。