重庆辣椒上烟草轻型绿花叶病毒的分子检测及全基因组克隆分析

辣椒是重庆重要的经济作物,烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus, TMGMV)引起的病毒病对辣椒生产造成了严重影响.为明确TMGMV在重庆辣椒上的发生、分布情况及其基因组特征,从重庆北碚、石柱、潼南和九龙坡4个区县采集29份疑似病毒病样品进行了RT-PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼接获得病毒基因组全序列并进行了系统进化分析.检测结果表明:29份样品中有9份检测到TMGMV,检出率为31.03%,其中石柱县的检出率最高,为60.00%.序列分析发现,重庆辣椒分离物TMGMV-TN29基因组全序列具有烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒典型基因组结构特征,由6 356 nt构成.系统进化分析得出,该分离物与TMGMV厦门分离物Xiamen (JX534224)具有较近的亲缘关系,核苷酸序列相似性达到99.75%.     

武隆烟区烟草病毒病的病原初步鉴定

对重庆市武隆烟区田间烟草进行了病毒病病原种类的调查和鉴定。26个烟草样品经ELISA共检测到TMV,CMV,PVY及TuMV等4种病毒。所有样品均感染TMV,且病毒复合侵染严重,其中,以TMV,TuMV,CMV及PVY等4种病毒的复合侵染为主,侵染率达30．77％。ELISA结果表明,复合侵染的样品中TMV含量最高,TuMV含量最低。     

番茄花叶病毒中国分离物的生物学特性及其基因结构分析(英文)

Ｔｏｍａｔｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＴｏＭＶ）ｉｓａｓｐｅｃｉｅｓｏｆＴｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ．Ｉｔｗａｓｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｅｄｉｎ１９０９ｉｎＡｍｅｒｉｃａ．ＴｏＭＶｐａｒｔｉｃｌｅｓａｒｅｓｔｒａｉｇｈｔｔｕｂｕｌｅｓ,ａｂｏｕｔ１８ｎｍｉｎｄ...     

柑橘碎叶病毒研究进展

起源于我国的柑橘碎叶病是严重危害柑橘的一种重要柑橘病毒病,国内外关于柑橘碎叶病毒的研究对于控制该病害起到了重要的作用。概述了国内外关于柑橘碎叶病毒的生物学、分子生物学、病毒的株系和控制方面的研究进展,尤其是对近些年用分子生物学方法研究病毒的基因组和株系序列差异方面的情况作了详细的介绍。并对柑橘碎叶病毒研究仍未解决的问题和进一步深入研究的内容进行了分析探讨。     

蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体研制

用蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）提纯病毒粒子免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,用纯化的ＢＢＷＶ病毒对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得２株ＢＢ－ＷＶ特异性单克隆抗体的细胞株,分别命名为４Ｄ１１,３Ｇ１２．２株单抗腹水间接ＥＬＩＳＡ效价高达１∶６４００００,抗体类型均为ＩｇＧ１,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ分析表明,２株单抗均是针对ＢＢＷＶ４４．７ｋＤ的外壳蛋白大亚基的特异性抗体．单抗抗原结合位点分析表明４Ｄ１１和３Ｇ１２两单抗作用于同一抗原决定簇     

核糖体失活蛋白(α-MC)亚细胞定位及对TMV的抑制作用

【目的】克隆获得苦瓜α-MC、商陆PAP,在烟草中异源表达观察两个蛋白在细胞中的定位情况。研究α-MC对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反应。【方法】根据已报道的商陆抗病毒蛋白PAP基因全序列和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP和α-MC基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、商陆PAP;用Wolf PSORT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、商陆PAP分别融合在GFP和Ds Red2的N端,构建融合蛋白表达载体,采用GFP和Ds Red2标记进行亚细胞定位,验证预测结果;通过农杆菌介导在本氏烟中瞬时表达α-MC,再接种烟草花叶病毒,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分别检测病毒在接种叶片的蛋白积累量和RNA表达量,分析瞬时表达α-MC的抗病毒效果。利用q RT-PCR分析植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,探究其抗病毒机理。【结果】克隆得到基因α-MC和PAP全长,分别为861和939 bp。Wolf PSORT预测显示α-MC和PAP主要定位于细胞质膜上。共聚焦荧光显微镜下观察发现,分别用GFP和Ds Red2标记的α-MC和PAP均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PSORT预测的α-MC和PAP定位结果相一致。异源表达的PAP对植物细胞毒性作用强,导致表达部位细胞坏死,异源表达α-MC的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达α-MC后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现α-MC处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6 d后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6 d后的叶片中,对照组与健康植物的OD492比值几乎已达到处理组的10倍以上;q RT-PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍左右,表明α-MC对TMV复制和移动均有明显抑制;q RT-PCR结果分析显示,NPR1在只注射TMV、单独表达α-MC以及表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约2.5倍左右,在只接种α-MC和表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均检测到PR1、PR2,但后者的表达量显著高出前者5—7倍,表明异源表达α-MC可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,从而引起更强的防御反应。【结论】异源表达α-MC显著抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达α-MC方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。     

产几丁质酶烟草内生细菌的筛选及产酶条件研究

从健康烟草叶片中筛选出一株产几丁质酶活性较高的内生细菌FEC-1，经16SrDNA基因序列和菌株生理生化特征分析，确定该菌株为环状芽孢杆菌。对FEC-1菌株产酶发酵条件研究表明，该几丁质酶是诱导酶，最佳氮、碳源是酵母膏和2g／L单糖或二糖，多糖效果相对较差，最适初始pH为9．0左右，最适温度为30℃左右。在优化条件下，摇瓶培养60h时产酶达123．16U／mL。     

温度对二点叶蝉的发育存活及繁殖的影响

在 15℃,20℃,25℃,28℃,32℃, 35℃恒温条件下,研究温度对二点叶蝉发育、存活和繁殖的影响.拟合二点叶蝉发育速率与温度之间的关系模型,求出各发育阶段的发育起点温度和发育上限、下限温度,组建不同温度下实验种群特定时间生命表,计算种群增长参数,分析种群增长参数与温度之间的关系.结果表明,在15℃下,卵不能完成发育,在35℃条件下3龄若虫不能存活.二点叶蝉种群增长最适温区为25～32℃.在该温区范围内,内禀生殖力为0.0631～0.0463,周限增长率为1.0561～1.0497,种群存活曲线属于Deevey I型,而在15℃不利条件下,种群存活曲线属于Deevey III型.     

PaLCuCNV和TYLCCNV复合侵染引起更严重的番茄黄化曲叶病

 从四川攀枝花市田间采集36份表现严重矮化、黄化和曲叶症状的番茄病株样本,利用双生病毒简并引物PA/PB从所有样本中均扩增得到约500 bp的片段,经全序列测定及分析,检测出中国番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV）和中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）,这两种双生病毒的复合侵染率达97.2%。系统进化分析表明,这两种双生病毒分别与已报道的PaLCuCNV河南番茄分离物（PaLCuCNV-[HeNZMI]）及TYLCCNV云南元谋烟草分离物（TYLCCNV-[Y295]）的核苷酸序列相似性最高,分别为99.1%和97.9%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNA β分子,全序列测定表明所得9个DNA β分子均为TYLCCNV的卫星TYLCCNB,且与其四川番茄分离物（TYLCCNB-[SC65]）的核苷酸序列相似性最高,为87.7% ~ 94.5%。本文首次报道PaLCuCNV与TYLCCNV/TYLCCNB病害复合体复合侵染番茄引起更严重的番茄黄化曲叶病。     

番茄SYTA的克隆及表达分析

【目的】克隆获得番茄SYTA(Solanum lycopersicum STYA,S.l SYTA),分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征,明确S.l SYTA亚细胞定位和组织表达,并分析其在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染下的表达变化及其对TMV移动的影响,为明确S.l SYTA在植物病毒侵染致病过程中的作用提供理论依据。【方法】根据番茄基因组含有的SYTA同源基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物,采用RT-PCR技术克隆S.l SYTA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的序列特征;使用MEGA 7.0对S.l SYTA蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;通过与GFP蛋白融合进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测番茄各部位S.l SYTA的表达量以及在TMV胁迫的番茄中S.l SYTA的表达变化;构建植物瞬时表达载体p CV-SYTA-m GFP,通过农杆菌介导在本氏烟草中瞬时表达,TMV-GFP攻毒,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA时TMV-GFP的积累和移动情况。【结果】克隆得到1 620 bp的S.l SYTA基因开放阅读框全长,序列比对及生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有SYTs家族的典型特征,含有N端的跨膜区、胞间连接区和C端的两个C2结构域;多序列对比及系统进化树分析发现,与茄科林生烟草、绒毛状烟草等植物亲缘关系较近,与黄瓜较远;亚细胞定位显示S.l SYTA定位于细胞质膜。在番茄的根、茎和叶中S.l SYTA的表达量从高到低依次为根叶茎;TMV-GFP侵染番茄导致其S.l SYTA表达量在接种后第1天显著上调,在第7天降至正常水平。在S.l SYTA瞬时表达的本氏烟叶片部位接种TMV-GFP,TMV-GFP在接种第5天时已经到达新叶,而接种部位仅表达空载体对照的本氏烟新叶中未观察到TMV-GFP,且接种第5天时TMV-GFP在接种叶和新叶中的积累量均明显高于其在空载体对照处理的叶片。【结论】获得的S.l SYTA具有SYTs家族的典型特征。S.l SYTA定位于细胞质膜,S.l SYTA在番茄根中表达量最高。在TMV-GFP胁迫下,番茄中S.l SYTA表达呈现先上升后下降至正常水平。在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA有利于TMV-GFP侵染初期的积累和移动。