柞蚕核型多角体病毒感染离体细胞的研究

柞蚕核型多角体病毒(Antheraea Pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus简称ApNPV)对樗蚕蛹精细胞和草地贪夜蛾Sf9细胞的感染是非同源昆虫细胞的感染。运用昆虫细胞培养、病毒感染及电子显微镜等病毒学技术研究了ApNPV在体外培养的樗蚕蛹精巢细胞中的感染情况,初步探明了ApNPV在体外培养昆虫细胞中的形态发生过程,表明它是典型的杆状病毒复制。并用该病毒以一定浓度感染草地贪夜蛾Sf9细胞,说明ApN-PV不能在Sf9细胞中复制。     

用cDNA末端扩增法克隆柞蚕攻击素(attacin)基因及序列分析

利用cDNA末端扩增(RLM-RACE)方法,克隆了柞蚕攻击素(attac in)基因cDNA序列(GenBank登陆号:AY960680)。柞蚕攻击素基因cDNA序列全长912 bp,其中699 bp的蛋白质编码区可编码233个氨基酸。预测蛋白质分子量为25 kD,等电点(pI)为7.54。柞蚕攻击素基因中包含2个内含子。S ignal P 3.0 Server程序分析结果显示,柞蚕攻击素第1-17位氨基酸为信号肽序列。蛋白质功能区分析预测,柞蚕攻击素在第47-112氨基酸之间为攻击素-N(attac in-N)功能区,第113-233位氨基酸之间为攻击素-C(attac in-C)功能区。以邻接法(ne igh-bor-join ing,NJ)建立了与其它昆虫攻击素的系统关系图。     

柞蚕微孢子虫体外培养技术体系的建立

建立了一套柞蚕微孢子虫株分离及体外增殖保存的技术体系。主要方法是利用柞蚕蛹精巢或卵巢组织制备原代细胞,分离、培养柞蚕微孢子虫;利用柞蚕蛹期滞育可以长期储存的特点,将柞蚕原代细胞分离、培养的柞蚕微孢子虫注射入健康柞蚕蛹体进行继代培养和长期保存;通过原代细胞分离培养、蛹体增殖和保存的交替循环体系,达到分离、增殖及保存微孢子虫株的目的。该技术体系既解决了微孢子虫来源困难,品种混杂不易分离和长期保存等问题,也为进一步探索柞蚕微孢子虫侵染、传播规律和提升柞蚕微粒子病防控效果提供了有力支持。     

柞蚕蛹卵巢原代细胞培养方法及培养基的选择试验

采用机械分散法和胰酶消化法,分别选取MGM-448、Grace、TC-100等3种培养基进行柞蚕蛹卵巢组织细胞的体外培养。在2个月的原代细胞培养期间,机械分散法获得的培养物在MGM-448培养基中贴壁效果好,细胞健康且生长旺盛;而在Grace和TC-100培养基中,细胞虽能贴壁,但生长较缓慢。胰酶消化法分散细胞的效果好,但在3种培养基中的细胞会出现轻微损伤而影响活力。综上认为,柞蚕蛹卵巢原代细胞的最佳培养方法为机械分散法,最佳培养基为MGM-448。     

柞蚕溶菌酶基因的克隆和序列分析

采用cDNA末端扩增(RACE)方法及简并引物克隆了柞蚕溶菌酶(Antheraea pernyilysozyme)基因(Gen-Bank登录号:DQ353869)。该基因cDNA序列全长675 bp,由3个外显子和2个内含子组成,其开放读码框(ORF)长420 bp,编码140个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的1-20位氨基酸为信号肽序列,21-140位氨基酸为柞蚕溶菌酶成熟蛋白(分子质量14 kD,等电点8.46)。柞蚕溶菌酶氨基酸序列中含有c型溶菌酶分子所特有的活性中心Glu32、Asp50以及8个半胱氨酸残基,与鳞翅目昆虫溶菌酶的氨基酸序列同源性较高,属非钙结合型c型溶菌酶。柞蚕溶菌酶的模拟三级结构与印度柞蚕(Antheraea mylitta)溶菌酶的三级结构十分相似。