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乙酰胆碱酯酶(Ach E)是有机磷(OP)和氨基甲酸酯类农药的作用靶蛋白,在体外胆碱激酶(choline kinase)可专一性地以三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸的供体,催化Ach E的酶促反应产物氯化胆碱发生磷酸化。依据家蚕基因组数据库中的胆碱激酶基因(Bmcok)序列(Gen Bank登录号:AK378994.1)设计合成特异引物,从家蚕5龄第3天幼虫头部克隆了家蚕胆碱激酶基因,在大肠杆菌中进行原核表达并纯化目的蛋白质,获得质量浓度约1.03 mg/m L的家蚕胆碱激酶液。纯化的家蚕胆碱激酶在30℃、p H 9.5时的活性最高,约为115.6 U/mg。通过耦合Ach E和家蚕胆碱激酶的酶催化反应,并结合ATP-荧光素发光反应,建立酶抑制-发光快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的方法。该方法对甲胺磷残留的检测限可达0.05μg/m L,灵敏度高于现有的酶抑制色卡法和酶抑制分光光度计法,初步表明了将家蚕胆碱激酶应用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测的可行性。 相似文献
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松材线虫RNA聚合酶基因的RNA干扰研究 总被引:2,自引:0,他引:2
克隆了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)RNA聚合酶基因片段,构建大量表达松材线虫RNA聚合酶基因片段的特异双链RNA(dsRNA)表达载体,并用表达的双链RNA(dsRNA)对松材线虫进行了RNA干扰实验。结果表明,松材线虫浸泡在20℃的RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d,其繁殖倍数为73.2;对照处理的繁殖倍数为322.8,两者的繁殖倍数相差4.4倍;松材线虫浸泡在4℃的RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d,其繁殖倍数为120.8。RNA聚合酶基因的双链RNA(dsRNA)浸泡明显的抑制了松材线虫的繁殖;并且发现利用浸泡法对线虫进行干扰试验,双链RNA(dsRNA)20℃浸泡的干扰效果要好于前人报道4℃浸泡的干扰效果。 相似文献
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利用公布的家蚕基因组序列,设计特定的家蚕微卫星引物,对8个不同品种家蚕的微卫星位点进行PCR扩增,所得PCR产物经变性与非变性聚丙烯凝胶(PAGE)分离,银染后发现在非变性PAGE上,条带较粗且模糊,非特异带较多,导致读带误差增大;而在变陛PAGE上,所得条带较细且比较清晰,非特异带明显减少,有利于降低统计误差。 相似文献
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利用RAPD标记技术检测杀虫剂阿维菌素对家蚕血细胞DNA的损伤,作为评价其对蚕体毒性的依据。分别用1、2、4、8μg/L阿维菌素药液处理的桑叶给4龄起蚕添食,96 h后对家蚕血细胞的基因组DNA进行RAPD分析。24条RAPD引物对5个样品基因组DNA扩增产生的清晰条带数为143条,其中多态性片段19条,多态性带数比率为13.29%。用Ntsyspc 2.1软件计算出不同处理样品血细胞DNA间的遗传相似系数分布在0.867~0.993,树状聚类图显示正常样品与1、2、4μg/L阿维菌素药液处理的3个样品聚为一类,而8μg/L阿维菌素药液处理的样品单独聚为一类,说明该样品血细胞DNA的变异最大。研究结果提示,RAPD标记作为杀虫剂对家蚕的毒性检测标志技术,可准确预警蚕区农药使用对养蚕生产存在的潜在危害。 相似文献
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通过检测家蚕未受精卵细胞中参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的几个关键基因的转录水平,分析热激诱导家蚕未受精卵发生孤雌生殖发育的分子机制。首先基于家蚕未受精卵RNA-seq数据分析表明,在家蚕孤雌生殖系和有性生殖系间,无论是经过热激诱导处理(46℃水浴18 min)或未热激处理的未受精卵,MAPK途径都存在差异表达的基因。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析MAPK途径的mos、mek、erk和p38mapk基因在热激诱导前家蚕孤雌生殖系及有性生殖系未受精卵之间的转录水平差异:位于MAPK通路中上游的2个基因mos和mek,无论中系品系还是日系品系中,均表现为在孤雌生殖系表达极显著下调(P0.01);而位于MAPK通路下游的基因erk和p38mapk,其转录水平在中系品系的孤雌生殖系与有性生殖系间无显著性差异,但在日系品系中则表现为在孤雌生殖系中极显著下调(P0.01)。qRT-PCR检测分析家蚕孤雌生殖系未受精卵的4个基因在热激诱导孤雌生殖发育过程中的转录水平变化也表现出差异性:热激处理后mos和mek的转录水平极显著下调(P0.01),并维持在低水平;p38mapk则在热激处理前后保持稳定;而热激处理后erk基因的转录先显著升高(P0.05),而后逐步下降,并维持在热激处理前的水平。研究结果提示,MAPK途径可能参与了热激诱导家蚕孤雌生殖发育过程。 相似文献
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