杂交竹梢枯病菌毒素蛋白纯化及致病力

撑×绿杂交竹(Bambusa pervariabilis×Dendrocalamopsis grandis)梢枯病是长江中上游退耕还林毁灭性病害之一,可造成严重的生态和经济损失。由于该病是近年来四川栽培区新发现的病害,相关研究较少,目前仅对该病的病原及发生规律(朱天辉等,2009a)、症状特点及空间格局(朱天辉     

水杨酸诱导山茶抗灰斑病的作用及生理生化响应

采用载玻片萌发法测定水杨酸(SA)对山茶灰斑病菌的影响。浓度为0～5mmol.L-1的SA对山茶灰斑病菌的孢子萌发没有抑制作用,其诱发抗病性可持续10～15天,诱导最佳间隔期为3天。用SA喷雾涂布叶片诱导山茶抗性,植株内丙二醛、木质素、可溶性蛋白含量等生化指标对山茶灰斑病菌诱导信号有不同响应。MDA含量在一定时间范围内减少,膜脂的过氧化程度降低,但随着处理时间的延长,这种诱导抗性的作用逐渐减弱,且在不同浓度处理间存在差异,在诱导并挑战接种的处理中,各处理表现为初期低于对照、后期缓慢上升;诱导并挑战接种的处理中,木质素含量的变化趋势与只诱导处理基本相似,高浓度诱导的木质素积累量大于低浓度;诱导并挑战接种处理的可溶性蛋白含量与只诱导处理也表现出相同的变化规律,诱导并挑战接种处理的可溶性蛋白含量比只诱导的处理和对照高。生化反应与病情指数的相关性分析表明:MDA、木质素含量与病情指数达到显著水平(P<0.05)。     

A蛋白间接酶联免疫法对杂交竹梢枯病菌蛋白毒素的检测

采用A蛋白双抗夹心法,在包被抗血清前先用A蛋白包被微量测定板,利用A蛋白抗血清中免疫球蛋白的FC部位结合,以F(ab’)2部位吸附抗原毒素,在被吸附的毒素上再加一层相同的抗血清和酶标记的A蛋白,以检测杂交竹梢枯病菌毒素蛋白。结果表明:A蛋白预包被能提高检测效价,降低本底值。抗原浓度对酶联检测有显著影响,纯毒素稀释倍数大于10-6,检测结果与对照接近,不适宜用于检测。OD值随抗原稀释倍数的增加下降,且下降幅度受测定抗血清浓度的影响;当检测液稀释1∶5(1∶50时,测定抗血清浓度在10-4(病株汁液)和10-6(含毒素发酵液)时可测出显著差别。抗血清浓度为10-4下,含毒素发酵液在标记A蛋白浓度为1∶10(1∶640范围内有较好测定结果,而病株汁液在标记A蛋白浓度为1∶10(1∶160才能测出。本研究首次将此技术用于真菌毒素检测中,该方法对杂交竹病株汁液中的致病毒素有高度的特异性和灵敏度,能早期诊断暗孢节菱孢菌引起的杂交竹梢枯病。     

杂交竹梢枯病菌毒素蛋白的质膜结合位点

为探明杂交竹梢枯病菌毒素蛋白的质膜结合位点及在不同品种的结合活性,在低压层析分离纯化毒素蛋白的基础上,以该蛋白免疫新西兰大白兔制备毒素特异性抗血清,并将该蛋白用不同浓度的抗体吸附后处理杂交竹幼嫩枝条。结果表明:毒素所引起的症状有不同程度的减轻,说明所制备的抗体在与毒素发生特异性免疫学反应的同时,可部分封闭毒素分子上与毒素受体结合的位点;利用竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)测定杂交竹嫩枝的质膜制剂与毒素蛋白的结合活性显示,质膜制剂与毒素结合后能部分阻断毒素与其抗体的免疫学反应,即质膜制剂中含有毒素的结合位点,且不同品种的结合活性有差异;用胰蛋白酶或加热处理质膜制剂后,质膜制剂对毒素与其抗体反应的抑制作用消失,证实质膜制剂中与毒素结合的是蛋白类物质。     

杂交竹抗梢枯病诱导因子筛选及其持续期研究

本文利用病原毒素同源异质的特点诱导杂交竹抗病潜力,筛选出抗梢枯病的最佳诱导因子并排除其对病原菌的直接作用,经琼脂玻片萌发法测定3种诱导因子(温度灭活毒素、蛋白酶降解毒素和细胞壁成分)对杂交竹梢枯病病原菌暗孢节菱孢菌孢子萌发的抑制作用,结果显示经过60℃灭活毒素浓度为40μg/mL处理的孢子萌发效果最为理想。通过最佳诱导因子对杂交竹不同品种诱导持续期进行测定,采用针刺法先接种诱导因子后挑战接种病原菌,1～40 d内观察抗感品种对诱导因子响应的差异,症状上杂交竹8#的感病程度重于3#和6#,40 d时叶片和枝干变黄干枯,病情指数结果表明,3个杂交竹品种接种诱导因子后感病程度降低,诱抗效果显示杂交竹6#的诱抗指数高于3#和8#。以上结果证明诱导因子使不同杂交竹品种均产生了一定的抗性且抗性越强的品种诱导抗性越好。     

暗孢节菱孢菌非蛋白类毒素的基本性质研究

用改进的Fries培养基在最佳条件下培养出的暗孢节菱孢菌[Arthrinium phaeospermum(corda)M.B.Ellis]滤液,采用硫酸铵沉淀制备蛋白类、非蛋白类粗毒素。经致病性检测,前者生物活性低于后者小分子毒素成分。基本性质研究显示非蛋白粗毒素有一定专化性,但专化性不强,介于专化性与非专化性毒素之间;具有较强的热和紫外线稳定性、对pH敏感,易受碱性物质影响;9种不同极性物质对毒素的生物活性有不同影响,该毒素可能为极性较大的物质。     

不同退耕还林模式对土壤生物学性质的影响效果评价

在测定土壤微生物、土壤酶活性基础上,应用主成分因子分析法建立了不同退耕还林模式下的土壤生物学性质评价体系。结果表明,土壤放线菌、真菌数量与转化酶、脲酶、纤维素酶、过氧化氢酶活性之间的相关性达到了极显著或显著水平优势微生物中的微球菌与转化酶,芽孢杆菌与纤维素酶,木霉和游动放线菌与过氧化氢酶,酵母菌与脲酶呈显著正相关关系放线菌、真菌及其微生物优势类群多样性指标在评价土壤生物学肥力质量时具有十分重要的作用4种土壤酶活性是土壤生物学肥力质量评价的重要指标而细菌、酵母等生物量较小的微生物对土壤生态肥力评价的贡献较小。用土壤综合肥力指标值(IFI)进一步评价各样地的土壤生物学肥力质量的顺序依次为:苦竹林表层>桦木林表层>农耕地表层>农耕地亚表层>农耕地深层>桦木和苦竹林亚表层>桦木林深层>苦竹林深层。苦竹对退耕地的生态改善效果,如水土保持、水源涵养和土壤生态肥力的增加等方面要优于桦木。     

拟松材线虫携带的可培养微生物种群研究

以云南松濒临枯死木为对象,利用贝尔曼漏斗法获得植物寄生性线虫,借助形态学和PCR-RELF相结合的方法鉴定出拟松材线虫,在此基础上,对其所携带的可培养微生物进行了分离纯化和鉴定,证实拟松材线虫共携带26种细菌和4种真菌,所携带可培养微生物随着拟松材线虫人工培养代数的增加,其多样性下降,人工培养3次以后,微生物的种类从30种降到9种。未纯化线虫致病性显著高于继代培养线虫,继代培养次数越多,致病性下降越快,说明体表可培养微生物参与了拟松材线虫的致病过程。     

杂交竹白纹羽病生防菌的筛选与应用

本文以健康杂交竹根际土为对象,在稀释平板法获得25株芽孢杆菌基础上,采用牛津杯法、打孔法测定两株目标生防菌发酵滤波对白纹羽病菌的抑制活性,筛选出最优B2菌株,盆栽试验证明该菌株有较高生防潜能,形态学与生理生化鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）.田间试验表明该菌剂100倍～200倍（体积比）稀释度沿根系幅面灌根,每株100 mL,每年春季施用一次,可预防白纹羽病发生;50倍～100倍（体积比）稀释度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌,每株200 mL,春、夏各一次,连续3a,可有效治疗白纹羽病,总体效果优于甲基托布津.     

板栗过氧化氢酶基因CmCAT的克隆与原核表达

【目的】旨在克隆板栗CmCAT基因全长cDNA序列,分析其编码蛋白相关信息并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR技术从板栗品种"石丰"中克隆获得CmCAT基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。构建原核表达载体pET28a-CmCAT,经PCR和酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。【结果】板栗CmCAT基因开放阅读框(ORF)为1 479 bp,共编码492个氨基酸,推测蛋白分子质量为56.883 kDa,理论等电点pI为5.83,GenBank登录号为KY312851。其核苷酸序列与核桃(Juglans regia)CAT基因序列相似性最高,为85%。遗传进化分析表明,板栗CmCAT与核桃的亲缘关系最近。SDS-PAGE电泳分析表明,在30℃条件下,0.2 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最佳,诱导的目的蛋白分子量约为60 kDa,其主要以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了板栗CmCAT基因,并对其编码蛋白的理化性质进行了预测分析,在大肠杆菌中获得了大量的表达,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。