OIE陆地动物诊断试验和疫苗手册(高致病性禽流感)

高致病性禽流感(HPAI)亦称鸡瘟,是由正粘病毒科的成员特定的A型流感病毒引起的.流感有三型A、B、C;只有A型流感病毒被认为能感染禽类.因为禽感染禽流感后的临床症状有多种表现形式,可因宿主、毒株、免疫状态、继发感染及环境条件的不同而有很大的变化,对该病的诊断是通过病毒分离和鉴定作出的.病原鉴定采集活禽气管和泄殖腔的拭子(或粪便)或者死禽的粪便和器官,加抗生素制成悬液,接种到9～11日龄鸡胚尿囊腔内.置35～37℃孵育4～7天,检测死胚和所有到孵化末期鸡胚尿囊液的血凝活性.尿囊液里的A型流感病毒可经浓缩和A型流感病毒共有的核衣壳或基质抗原的抗血清作免疫扩散试验确诊.目前,在特定条件下,病毒分离法已经被反转录多聚酶链式反应取代.进行病毒亚型鉴定,实验室必须具备用于免疫扩散试验的抗每一种亚型A型流感病毒的15种血凝素(H1～H15)抗原和9种神经氨酸酶(N1～N9)抗原的单因子抗血清.除此之外,新分离的病毒也可以用一系列能覆盖所有亚型的各种毒株的多克隆抗血清进行血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验来鉴定.HPAI和"鸡瘟"是特指A型流感病毒强毒株的感染,因此,有必要评估分离毒株对家禽的毒力.虽然至今所有分离到的强毒株不是H5亚型就是H7亚型,但大多数H5或H7分离毒株是低毒力的.近年来,随着对禽流感致病性的分子机理的了解,出现了一些检测禽流感毒力的方法,但是,最基本的方法还是把病毒接种于至少8只4～8周龄的易感鸡,10天内如果死亡率高于75%,则认为该病毒株为高致病性.疑似致病毒株的分离鉴定应该在病毒安全实验室进行.血清学试验由于所有A型流感病毒的核衣壳和基质蛋白的抗原性都相似,可用琼脂凝胶免疫扩散试验来检测针对这些抗原的抗体.该试验所用的浓缩抗原含有这两种抗原中的任何一种或全部,但不是所有禽类感染后都能出现沉淀抗体.血凝抑制试验可作为禽流感的常规血清学诊断法,但由于血凝素具有亚型特异性,可能会出现漏检现象.酶联免疫吸附试验(ELISA)已经用于检测抗A型流感病毒特异性抗原的抗体.对疫苗和诊断用生物制品的要求大多数国家,政府机构都禁止或不鼓励使用疫苗来控制或预防HPAI,因为这可能会干扰扑灭政策的实施.在20世纪90年代,墨西哥和巴基斯坦为了控制广泛暴发的HPAI,采用油乳剂灭活苗进行该病的预防,在墨西哥表达同源HA基因的重组禽痘病毒苗也进行了田间试验.1999～2001意大利暴发禽流感时,采用的灭活苗的疫苗株和野毒株有相同的血凝素但神经氨酸苷酶不同,这样就能够区别疫苗免疫禽和野毒感染禽.如果应用HPAI生产疫苗或做攻毒试验,需要具备OIE规定的第4类病原防护设施.     

山羊痘云南流行毒株及疫苗株P32基因序列分析

将本实验室分离到的山羊痘病毒云南流行毒株MYS、XW、XD及疫苗株VF4主要结构蛋白基因P32基因克隆到PMD18T载体后进行双向测序,所得序列与Genbank中羊痘病毒属成员:山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(SLDV)参考毒株相应序列作对比分析(ByClustalWMethod),结果显示:(1)MYS、XD毒株P32基因全长969bp,疫苗株VF4为974bp,XW毒株为975bp。(2)XW、疫苗株VF4在100～105bp位置处均插入6个A,在947bp位置缺失一个T;SPPV参考毒株在169～171bp位置插入GAT。(3)由于疫苗株VF4P32基因核苷酸序列第414位置处发生了T/A突变,在该处形成一个新的终止密码子TAA,导致完整的开放读码框架(ORF)被打断,只表达第1～411bp(137个Aa)的基因片段,而不能表达出完整的P32蛋白。其余6株毒株的开放读码框架均很相似。(4)在所构建的系统发生树中,LSDV与SPPV参考毒株、MYS和XD株、VF4和XW株、GTPV参考毒株各被划分为一组。所有7个毒株P32基因核苷酸序列的同源性都很高,均在97%以上。其中疫苗株VF4与SPPV参考毒株的同源性最低,为97.6%。XD与XW毒株的同源性最高,为99.8%。(5)酶切位点分析结果显示,MYS、XW、XD、VF4及GTPV和SLDV参考毒株具有唯一的HinfI酶切位点,大约在第694bp位置。SPPV参考毒株具有2个HinfI酶切位点,分别在第391bp和691bp位置处,该酶切位点较适合用来鉴别山羊痘和绵羊痘病毒,而疙瘩皮肤病在临床上就很容易与山羊痘和绵羊痘鉴别开来。     

2013—2019年我国流行性出血病病毒血清1型毒株的分离与遗传特征分析

【目的】掌握流行性出血病病毒（Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV）血清1型毒株（EHDV-1）在我国南方地区的流行情况及其遗传特征,为开展EHDV-1血清型特异性诊断、流行病学调查和致病性研究提供科学依据。【方法】2013—2019年通过在我国云南、广东和广西设立牛羊虫媒病毒监控点和哨兵牛,定期采集哨兵牛血液样本进行虫媒病毒分离;通过微量中和试验确定EHDV分离株的血清型,然后对EHDV分离株的部分基因节段（Seg-2、Seg-3和Seg-6）进行RT-PCR扩增、双向测序及序列分析,并利用BioEdit计算EHDV基因组各节段核苷酸序列及其推导氨基酸序列的相似性。【结果】2013—2019年从云南、广东及广西的虫媒病毒监控点共分离获得33株EHDV,其中7株为EHDV-1型毒株。分离获得的7株EHDV-1型毒株Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列高度同源,其平均相似性分别为（97.65±1.51）%、（94.87±4.72）%和（97.61±1.41）%,对应的推导氨基酸序列相似性平均为（97.69±1.36）%、（99.49±0.32）%和（97.51±2.47）%。基于Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树均显示,不同EHDV-1型毒株可划分为东方（Eastern）和西方（Western）2种地域型,东方地域型毒株分离自中国、日本及澳大利亚,西方地域型毒株主要来源于美洲和非洲。在基于Seg-2核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株归属于西方地域型,且聚类形成一个相对独立的进化分支;在基于Seg-3核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株分属2种地域亚型（Eastern-1和Eastern-2）,分别与日本EHDV-1型和EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系;在基于Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株属于东方地域型,与日本EHDV-1型毒株具有较近的亲缘关系。【结论】EHDV-1型毒株已在我国南方地区广泛流行,其Seg-2和Seg-6序列分别具有最近的共有祖先病毒,而Seg-3序列来自不同的祖先病毒。西方地域型毒株Seg-2序列在我国流行EHDV-1型毒株中的出现,说明西方地域型毒株在侵入我国后可能与本土流行的毒株发生重配,即我国流行EHDV-1型毒株为西方地域型与东方地域型的重配型毒株,为防范强致病性西方地域型毒株传入我国而造成畜牧业重大经济损失提供了警示。     

口蹄疫病毒结构蛋白P1研究进展

口蹄疫病毒P1基因编码的结构蛋白是构成口蹄疫病毒衣壳的基础,对诱导动物机体产生中和抗体和其他保护性免疫反应有重要作用.文章综述了口蹄疫病毒结构蛋白的结构、抗原特性以及利用重组P1基因制备口蹄疫新型疫苗和诊断检测制剂的最新研究进展.     

猫免疫缺陷病毒在医学中的应用

猫免疫缺陷病毒（Feline immunodeficiency virus，FIV）是一种主要感染猫的反转录病毒。FIV与人的免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）有许多相似性，可作为HIV的研究模型，如测量FIV病毒在动物体内的感染曲线，可为了解HIV在人体内的传播细节提供蓝图；利用FIV偏好感染发展中的神经系，可以帮助人们了解艾滋病（Acquired immure deficiency syndrome，AIDS）对神经系统的致病机理。FIV疫苗的研究获得成功，可为HIV疫苗的研制提供提示。FIV在基因治疗方面有重要的应用价值，目前应用FIV传递CFTR（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）的cDNA到呼吸系统表皮细胞治疗囊肿性纤维化（cysticfibrosis，CF）的研究已经取得了很大进展。     

2017—2018年云南省边境地区阿卡斑病毒抗体检测

为了解云南边境地区近年来阿卡斑病毒(Akabanne disease virus,AKAV)流行情况,2017—2018年连续2年在云南省与缅甸、老挝、越南接壤的12个边境县采集牛血清,应用cE LISA方法进行AKAV抗体检测。结果显示:2017—2018年共检测牛血清样品1 860份,检出阳性样品108份,阳性率为5.8%,显示这些地区存在一定的AKAV感染;各县AKAV抗体阳性率在0～24.4%之间,差异较大,其中抗体阳性率最高的为富宁县,2017年和2018年的阳性率分别为24.4%和20.0%,而瑞丽连续2年未检出抗体阳性;黄牛AKAV抗体阳性率(6.6%)高于水牛(4.7%),差异显著(P<0.05);入境牛抗体阳性率(6.5%)高于境内牛(3.0%),差异显著(P<0.05);养殖场(9.0%)、交易市场(8.4%)、屠宰场(7.6%)的牛AKAV抗体阳性率高于村寨散养户(2.5%),差异极显著(P<0.01)。结果表明,AKAV在云南边境地区存在一定的流行,其流行趋势受入境动物影响。结果提示,应继续加强云南省边境地区AKAV等虫媒病毒病的监控,及早发现和控制该病流行。     

蓝舌病病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立蓝舌病病毒(BTV)病原学检测方法,本研究以纯化的BTV-1免疫绵羊和兔子,制备高免血清。以绵羊抗BTV血清为捕捉抗体、以兔抗BTV血清和羊抗兔Ig G-HRP为检测抗体建立了检测BTV的抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法。该方法能够特异性检测BTV,对羊痘病毒、赤羽病病毒无交叉反应,与鹿流行性出血热鸡胚样品有微量交叉反应,但样品OD450nm/阴性对照OD450nm低于阴阳性临界值,不影响结果判定;敏感性试验检测结果表明该方法可以检出102.79 TCID50的病毒;批内和批间重复性试验变异系数分别为1.44%~8.46%和2.26%~12.44%;采用该方法与RT-PCR方法对60份鸡胚样品进行检测,阳性符合率为90%。本研究建立的AC-ELISA方法为BTV抗原检测提供了一种快速、实用的技术手段。     

云南山羊痘流行毒株P32基因的克隆与表达

山羊痘是由山羊痘病毒引起的一种严重的、高度接触传染的动物疾病,被国际兽疫局(OIE)列为A类动物传染病.临床上以体温升高、全身性或局部性皮肤痘疹及内脏病变(特别是肺)乃至死亡为特征.山羊痘病毒(GTPV)属痘病毒科脊索动物亚科羊痘病毒属的成员,该属其他成员还有绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(LSDV).P32抗原是一种结构蛋白抗原,包含有一个主要的抗原决定簇,存在于所有的羊痘病毒属的3个成员中.针对山羊痘病毒与副痘病毒属存在免疫交叉反应,缺乏有效的鉴别诊断试剂盒,本研究克隆表达出羊痘病毒属特异的P32蛋白,为进一步研制抗体及抗原检测试剂盒奠定前期工作基础.     

蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用

目的 建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。方法 选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。结果 三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10 μL^-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。结论 本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。     

蓝舌病病毒血清9型毒株在我国的首次分离

旨在分离流行于我国云南省的蓝舌病病毒(BTV),掌握分离BTV的遗传特征与感染特性。采用"鸡胚—C6/36细胞—BHK-21细胞"接种的方式,采集哨兵牛的BTV阳性血液进行病毒分离;采用血清中和试验以及Segment 2与Segment 6ORF区的克隆测序确定分离病毒的血清型;通过病毒噬斑形成和增殖曲线的测定,分析病毒在BHK-21细胞的增殖特性;通过qRT-PCR与血清中和试验分析BTV感染动物血液中病毒含量与中和抗体动态变化情况。结果显示:2013年8月,在云南芒市设定的哨兵牛中分离出一株BTV(毒株号V013/YN/2013),血清中和试验显示V013/YN/2013为BTV-9型病毒,Segment 2与Segment 6序列分析表明分离的病毒属BTV-9Eastern型,与日本毒株和澳大利亚BTV-9型毒株具有最近的亲缘关系。病毒噬斑与增殖曲线测定结果显示V013/YN/2013在BHK-21细胞上增殖能力明显强于BTV-9型参考毒株。自然感染V013/YN/2013的牛在连续5个月的监控期内未出现临床症状,感染动物虽产生了特异性中和抗体,但血液中始终能持续检测到病毒核酸。本研究首次报道了BTV-9Eastern型毒株V013/YN/2013在我国的分离,为进一步开展中国BTV-9型病毒的全基因组测序、诊断方法的建立、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。