云南江城蓝舌病病毒16型毒株分离鉴定及其L2基因序列分析

为了解近年来云南江城县蓝舌病病毒16型（Bluetongue virus type 16,BTV-16）毒株的流行情况及其L2基因与国外流行株的遗传进化关系,本研究将江城县送检的300份牛肝素钠抗凝血提取红细胞后静脉接种10日龄鸡胚,将收集的鸡胚肝脏捣碎离心,上清液接种于C6/36和BHK21细胞传代。针对出现细胞病变的样品,应用群特异性VP7片段引物进行RT-PCR检测,应用BTV-16 L2基因特异性引物对检测出的BTV核酸阳性样品进行RT-PCR扩增和测序,采用DNAStar和Mega 6.0软件对获得的L2基因编码区序列进行核苷酸、氨基酸同源性比对及遗传进化分析,同时利用BTV-16标准阳性血清对分离到的病毒进行中和试验鉴定。结果显示,江城县发现30个可致细胞病变的样品,其中17个样品经RT-PCR初步确认为BTV;经L2基因序列分析和中和试验鉴定,确定其中6株为BTV-16型毒株;核苷酸、氨基酸同源性比对分析结果显示,6个毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在93.4%~98.0%和94.2%~99.1%之间;遗传进化分析发现,其中5株与2001-2008年日本及1982-2011年印度分离的BTV-16毒株亲缘关系较近;1株与1985-1990年日本分离的BTV-16毒株亲缘关系较近。本研究发现,云南江城县BTV-16毒株呈现新旧毒株交叉持续流行态势,但在自然进化中遗传变异不大,有一定的稳定性,本研究在分子水平阐明了云南江城县地方流行BTV-16 L2基因间的遗传和差异,为进一步开展BTV分子流行病学及检测研究提供科学依据。     

云南省边境地区哨兵牛芒市病毒的分离与鉴定

目的 掌握云南省边境地区动物虫媒病毒的多样性分布和传播风险。方法 在云南省景洪市设立哨兵牛3头,每周1次采血进行虫媒病毒的监测与分离。通过电镜观察、基因组琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR与克隆测序对分离病毒进行鉴定,采用实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。结果 2019年,在监测期第13周,从1头哨兵牛的血液中分离出1株致C6/36细胞病变的病毒(V301/YNJH/2019),电镜观察可见直径约70 nm、呈二十面体对称结构的病毒粒子,琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组为双链RNA,RT-PCR鉴定分离毒株为芒市病毒(MSV)。测序显示,分离毒株的基因节段Seg-4和Seg-7长度为2 055和1 122 bp,编码病毒的外层衣壳蛋白VP4(628 aa) 和VP7(298 aa),基因节段Seg-2和Seg-9长度为3 055和1 076 bp,编码病毒的内层衣壳蛋白VP2(956 aa) 和VP9(283 aa);分离毒株与云南省芒市分离的MSV/DH13M041毒株具有最近的亲缘关系,核酸序列相似度在97.4% (Seg-9)~98.5% (Seg-2)之间,氨基酸序列相似度在96.4%(VP9)~98.4%(VP2)之间。病毒感染的回溯分析显示,监测期的第11周,牛血液中病毒核酸检测呈阳性,病毒核酸含量在第13周达到高峰,随后快速降低,在第18周转为阴性;感染哨兵牛在监测期的第13周已产生特异性中和抗体(1∶14),在第16~18周处于高峰(1∶226),至监测结束的第24周降低为1∶57。结论 本文从牛体中分离到了MSV,表明牛是MSV的易感动物之一,病毒在感染牛上呈“一过性感染”的特征。研究结果为进一步开展MSV的检测诊断、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。     

小反刍兽疫灭活抗原RT-PCR检测方法的建立及其相关序列分析

以灭活的检测用抗原为材料,抽提灭活小反刍兽疫病毒的基因组RNA作为模板,根据参考文献及GenBank下载的序列,设计3对位于F基因的引物(2对为套式引物),进行RT-PCR扩增及扩增片段的T载体克隆、序列分析。结果显示,所设计引物单独或套式RT-PCR对模板均有预期大小的片段扩增;扩增片段经核苷酸序列测定和分析,表明所扩增片段为小反刍兽疫病毒的F基因片段。且所设计引物对同属牛瘟病毒、犬瘟热病毒无扩增,证明所用引物为小反刍兽疫病毒特异性引物,此3对引物可用于小反刍兽疫与牛瘟等同属病毒的鉴别诊断。     

口蹄疫的诊断与防控技术概述

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种危害严重的偶蹄动物传染病,对畜牧业的发展影响极大.从诊断技术,疫苗接种、消毒技术、隔离措施等多方面阐述口蹄疫防制特点。     

禽流感病毒M1蛋白表(拟)位定位及免疫检测分析

为对禽流感病毒(AIV)M1蛋白表(拟)位进行分析,本研究采用针对AIV M1蛋白的型特异性单克隆抗体(MAb),淘选M13噬菌体展示的7肽随机肽库,进行M1蛋白表(拟)位分析。筛选获得共有序列MDRxL或HPR,定位于M1蛋白93～99位(93MDRAVKL99)和222～230位(222HPNSSAGLR230)氨基酸区域。采用ELISA、竞争性ELISA分析不同噬菌体拟位与抗M1的MAb免疫反应性,表明含有MDRxL或HPR基序的噬菌体拟位能够与MAb发生特异性结合,并且其结合能够被天然病毒抗原抑制或阻断,表明拟位多肽真实模拟病毒蛋白上与MAb结合的抗原决定簇或表位,提示M1蛋白93～99位(93MDRAVKL99)和222～230位(222HPNSSAGLR230)氨基酸区域构成AIV型特异性表位。     

O型口蹄疫病毒P1-2A基因重组杆状病毒的构建及其表达

设计合成特异引物,扩增O型口蹄疫病毒(O/FMDV)P1-2A基因,将其克隆至T载体上,通过Hind Ⅲ和Not Ⅰ双酶切P1-2A基因和真核转座载体pFastBac^TM Dual,构建重组转座质粒pFastBac-P12A,再将pFastBac-P12A转化入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P12A。将Bacmid-P12A质粒转染Sf9昆虫细胞,出现典型CPE。病变细胞经Dot blotting和SDS-PAGE检测和分析,结果表明,O/FMDV P1-2A蛋白在Sf9细胞中获得表达,为O型FMDV特异性蛋白。     

防治韭蛆药剂筛选试验

韭蛆是韭菜迟眼蕈蚊的幼虫,在地下部为害韭菜鳞茎和根,导致地上部叶片变黄枯死,一般药剂难以凑效,防治该虫是韭菜生产上的一大难题。根据保质、保产、保环境的要求,     

云南鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A 及16S rRNA序列分析

为了探讨鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)云南流行株的外膜蛋白A (OmpA)的基因序列差异及其与16S rRNA序列的相关性,PCR扩增18株云南流行株鸭疫里默氏杆菌OmpA基因及16S rRNA核苷酸序列,分别构建其系统进化树,分析其系统进化关系。结果表明,18株鸭疫里默氏杆菌OmpA基因分为2个群,其同源性分别为86%~99.2%和92.6%~100%。18株鸭疫里默氏杆菌16S rRNA基因同属1个群,同源性高达96.1%~100%。 RA-1、RA-2、RA-11和RA-39 4株分离株的OmpA基因位于进化树的同一个亚群,其16S rRNA基因也位于进化树的同一亚群,两者呈现出明显的相关关系,其他14株分离株的OmpA基因系统进化树与16S rRNA基因系统进化树无明显的相关关系。     

不同温度下蓝舌病病毒的毒价变化研究

[目的]为蓝舌病病毒的长期保存奠定基础。[方法]在70、-20、4和20℃下保存蓝舌病病毒1个月后,测定其毒价变化,研究不同温度对蓝舌病病毒毒价的影响。[结果]在室温和4℃下保存1个月后蓝舌病病毒毒价保持不变。在-70℃下保存1个月后蓝舌病病毒毒价从原来的5.5降至4.2。在-20℃下保存1个月蓝舌病病毒毒价变化最大,从原来的5.5降至2.8。[结论]长期保存时,应将蓝舌病病毒在-20℃下保存。     

中国蓝舌病病毒血清5型毒株的分离与鉴定

目的获取中国蓝舌病病毒血清15型(BTV-15)毒株的全基因组序列并分析其遗传特征。方法通过全长cDNA扩增与高通量测序技术获取中国1996年分离的BTV-15型毒株B105/YN/1996的全基因组序列,进行序列比对并构建系统发生树。结果序列分析结果显示：B105/YN/1996毒株基因组全长19 154 bp,各基因节段长度在822 bp (Seg-10)~3 944 bp (Seg-1)之间,编码蛋白大小在216 (NS3a 蛋白)~1 302 (VP1蛋白)个氨基酸残基之间。B105/YN/1996毒株的Seg-1、-2、-3、-4、-6与澳大利亚2012年分离BTV-15型毒株的对应基因节段之间具有最近的亲缘关系,Seg-7、-8、-9、-10则与中国BTV-15型V447毒株、BTV-4型YTS4毒株和BTV-1型Y863毒株的序列相似度最高;Seg-5与印度BTV-1型毒株IND1992/02具有最近的亲缘关系。在构建的系统发生树上,B105/YN/1996毒株的Seg-2与Seg-6归属于东方型,Seg-3与Seg-4则构成独立远东型;Seg-7、-10分别构成独立东方-1与东方-2型。结论中国BTV-15型毒株B105/YN/1996的不同基因节段在遗传进化上呈现高度多样性的特点,提示该毒株为基因重配毒株;该毒株的Seg-3、-4、-7、-10形成了独特的地域型,提示中国BTV-15型毒株在进化上的特殊性。