植物中尿素循环相关酶及代谢产物研究进展

尿素循环中间产物在植物的生长发育、生物与非生物胁迫起着重要的作用,也与植物氮素利用密切相关。本文以参与尿素循环的酶为重点,介绍其结构和功能研究的进展,并分析了与尿素循环相关的代谢及产物的作用,为进一步研究尿素循环的功能、调控和利用提供参考。     

棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的cDNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸（L-Cit）和L-精氨酸（L-Arg）含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶cDNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得cDNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用qRT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将GhASS1的开放阅读框连接到原核表达载体pCold-TF上,构建融合表达载体pCold-GhASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同NaCl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花GhASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其cDNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 kD,等电点6.74;序列比对分析表明GhASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示GhASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中GhASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测GhASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体pCold-GhASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 kD,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与对照菌相比,pCold-GhASS1工程菌中游离L-Cit含量下降,L-Arg含量上升,且在生长周期中较快进入对数生长期;在含高浓度NaCl的培养基中pCold-GhASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值,显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因cDNA序列GhASS1,推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。     

内蒙古干旱区3种豆科木本植物的组织培养

本文对内蒙古干旱区3种豆科沙生木本植物：柠条、花棒、羊柴进行了组织培养,分别诱导3种植物成苗,对不同植物的外植体脱分化和愈伤组织再分化培养基进行了筛选,并对其作用进行了分析。组织培养的成功与否与植物本身的生态生物学特性以及细胞全能性在离体条件下的表述程度有很大关系。     

枯草芽孢杆菌S-16抑菌活性物质的理化性质及培养条件的研究

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-16对向日葵菌核病有较好防治效果,本试验对其产生抑菌物质的理化性质进行了研究.结果表明,抑菌物质经20℃处理1h后,抑菌效果最显著,抑菌圈直径最大,为1.72 cm(包含孔的直径0.70 cm),虽然随着温度的升高抑菌物质的活性在下降,但是经80℃处理1h的抑菌物质仍有活性,抑菌圈直径为1.00 cm(包含孔的直径0.70 cm),说明该抑菌物质有热稳定性;且经过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等3种蛋白酶对该抑菌物质进行处理后,菌株S-16产生的抑菌物质的抑菌活性无显著影响,说明该类抑菌物质对蛋白酶稳定;另外,经紫外灯照射30 min的抑菌圈直径为1.57 cm,对照的抑菌圈直径为1.85 cm,虽然抑菌活性下降,但抑菌物质仍有抑菌活性,进一步证明菌株S-16产生的抑菌物质为一种脂肽类物质.同时,试验提出了最利于菌株S-16产生抑菌物质的培养条件是以葡萄糖为碳源,以牛肉浸膏为氮源,40 mL(100 mL三角瓶)的装液量,pH为中性条件下,20～40℃培养.     

病毒诱导的精氨琥珀酸合成酶基因沉默对棉花氮代谢的影响

以棉花为研究对象,利用转录后基因沉默技术(VIGS)将棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)基因沉默,研究沉默后植物的氨基酸、多胺、一氧化氮(NO)等含氮化合物的代谢变化。结果表明:盐胁迫可以诱导棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)瞬时上调表达,GhASS1沉默严重影响氨基酸的合成,除天门冬氨酰(Ans)外,其他蛋白质组成型氨基酸质量分数显著降低,NO质量摩尔浓度和多胺(PAs)质量分数下降,棉花植株生长发育迟缓。GhASS1沉默对棉花精氨酸脱羧酶基因(GhADC)、棉花鸟氨酸脱羧酶基因(GhODC)表现出强烈的抑制作用,进而影响植物多胺的代谢和耐盐能力。高浓度盐环境下,沉默体系精氨酸(Arg)和NO质量摩尔浓度上升,GhARG1表达上调。GhASS1沉默对于植物是致命的,GhASS1是尿素循环和氨基酸代谢的关键环节,GhASS1沉默使GhARG1、GhADC和GhODC表达下调,严重影响整个氨基酸代谢,NO质量摩尔浓度,腐胺(Put)和精胺(Spm)质量分数显著降低,N代谢受阻,植株发育不良,生长迟滞,棉花中存在Arg-NO通路。