中国小麦转基因研究的现状及前景

近年来,中国小麦转基因育种研究发展迅速,并成为常规育种的有效补充。分析了各类转基因方法在小麦遗传转化中的应用情况,综述了中国小麦转基因分子育种的发展及现状,主要包括小麦抗病虫、品质改良以及耐非生物逆境胁迫等方面的转基因研究,并分析了目前小麦转基因育种中存在的问题及发展策略。     

小麦水氮耦合效应与水肥高效利用研究

为了研究不同水氮耦合在小麦灌浆期的光合特征参数、水分利用效率及产量和耗水量等方面的效应,探索小麦高产高效水氮最佳组合。以半冬性小麦品种周麦22号为试验材料,通过防雨棚下子母盆栽的方法,在返青至拔节期土壤相对含水量55%的基础上,设置拔节至成熟期土壤相对含水量55%(H1)、65%(H2)、70%(H3)、75%(H4)、85%(H5) 5个水分水平;设置不施氮(0 kg/hm~2,N0)、施中氮(195 kg/hm~2,N1)和施高氮(270 kg/hm~2,N2) 3个氮素水平。结果表明,氮肥对产量、耗水系数和肥料利用效率的影响达极显著水平,水氮之间的交互效应达极显著水平。在施中氮和土壤相对含水量65%～70%的条件下,小麦整个灌浆时期的净光合速率、蒸腾速率显著高于其他处理,其中,花后10 d蒸腾速率超过11mmol/(m~2·s),灌浆速率提升15%～64%以上,水分利用效率高于1. 7 g/kg,氮肥偏生产力和氮肥农学利用率分别高于15. 1,7. 5 kg/kg,是小麦获得较高水肥利用效率、最大灌浆速率及产量的最优组合。因此认为,施氮量195 kg/hm~2,拔节至成熟期土壤相对含水量65%～70%的条件下,小麦获得高产的同时能够兼顾水肥高效利用。     

超高产优质广适小麦新品种——豫农416

豫农416是河南农业大学以豫麦49为母本、(豫麦21/豫麦35)F1为父本进行杂交,通过系谱法选育而成的超高产优质广适小麦新品种.该品种2009年9月通过河南省农作物品种审定委员会审定,审定编号:豫审麦2009001.豫农416已申请农业部植物新品种保护,品种权公告号:CNA005366E.     

低温积累与光周期对小麦发育特性调控的分子机理研究进展

温度和光照是影响小麦发育的主要因素,不但决定了小麦生态型的区域分布,也通过调控小麦的发育阶段、器官建成、穗分化起始及进程等因素而影响小麦的产量。本文介绍了低温春化和光周期对小麦发育特性影响的分子基础,对其调控机制及互作模式研究进展进行了综述。     

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97％以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导1-5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。     

小麦TaLEA4基因的克隆和表达

为探讨小麦胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)在水分胁迫过程中的生物学功能,以PEG6000(20%)处理6.0 h的洛旱2号幼苗为材料,利用RT-PCR方法克隆了小麦的TaLEA4基因,并分析了该基因在水分胁迫过程中的表达特征.序列分析显示,TaLEA4基因编码的蛋白具有2个典型的LEA4保守域.半定量RT-PCR分析表明,在小麦幼苗根系中,随着PEG6000介导的水分胁迫时间的推移,该基因的表达量逐渐上升,24 h达到最强,48 h又迅速回落;而在小麦幼苗的叶片中,该基因在水分胁迫0.5 h的表达量较强,其他时间点的表达水平都较低.可见,TaLEA4基因与小麦水分胁迫反应密切相关,该基因在根系和叶片中的不同表达特性预示着该基因在根系和叶片的水分胁迫反应中发挥着不同的生物学功能.     

马铃薯C-8,7甾醇异构酶基因(StSI1) cDNA克隆及表达

 以拟南芥C-8, 7甾醇异构酶的氨基酸序列为信息探针搜索GenBank数据库, 对高度同源的马铃薯EST序列进行拼接、引物设计和RT2PCR扩增, 扩增产物测序结果证实获得一个马铃薯C-8, 7甾醇异构酶基因(StSI1) 的全长cDNA序列。序列分析结果显示, StSI1全长886 bp, 包含59 bp的5′非编码序列、161 bp的3′非编码序列和一个长度为666 bp编码221个氨基酸的开放阅读框, 分子量约为25 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白的N端含有一个长度由35个氨基酸残基组成的信号肽, C端成熟肽区域含有典型的类EBP结合域。氨基酸比对分析表明, StSI1与已知C-8,7甾醇异构酶同源性介于32.9% ～61.3%之间, 与拟南芥AtSI1相似性最(61.3% ) 。RT-PCR 表达谱分析显示, StSI1在马铃薯的块茎芽眼和表皮组织中均能表达, 并且该基因的表达水平受贮藏温度升高和光照增强的正向调节。     

小麦16.9 kD热激蛋白cDNA克隆及其表达分析

为进一步了解小分子量热激蛋白在小麦耐热能力中的作用,根据玉米16.9 kD小分子热激蛋白的氨基酸序列,采用同源序列法进行序列拼接和引物设计,用RT-PCR扩增获得了1个源自小麦叶片的热激蛋白基因cDNA片段,即TaHSP16.9-1(GenBank登录号为EU649679).TaHSP16.9-1全长770 bp,5′非翻译区81 bp,3′非翻译区233 bp,开放阅读框编码151个氨基酸.序列分析结果表明,此蛋白与已知单子叶植物来源的同类基因高度同源,相似性介于78.3%～96.7%之间.定量RT-PCR表达谱分析显示,TaHSP16.9-1在小麦抽穗期的茎和旗叶以及幼苗期叶片中均能表达,其在小麦幼苗叶片中的表达受高温胁迫的诱导.     

大麦衔接蛋白AP 3复合体 HvMu3 基因的克隆及表达分析

为研究大麦衔接蛋白AP-3复合体的功能,根据Mu3亚基的保守氨基酸序列,借助生物信息学搜索大麦EST序列,拼接了一个大麦(Hordeum vulgare)衔接蛋白AP-3复合体Mu3亚基基因(HvMu3),以大麦叶片来源的DNA做为模板,采用RT PCR扩增HvMu3基因.采用半定量RT-PCR及荧光定量PCR(qRT-PCR)对该基因的组织表达特性以及ABA、NaCl和Cr6+胁迫条件下的表达模式进行分析.结果表明,HvMu3完整阅读框全长为4 439 bp,包含8外显子和7内含子,编码417个氨基酸残基,其中含有1个MHD结构域,属于衔接蛋白AP-3复合体Mu3亚基的典型特征,是首次克隆获得大麦衔接蛋白AP-3复合体Mu3亚基基因HvMu3;HvMu3在供试样品的根、茎、叶、胚和胚乳中均能表达,以胚中表达量最高,根、茎和叶次之,胚乳中表达量最低,表明该基因在大麦的旺盛生长组织中表达强烈;HvMu3在大麦幼苗叶片中的表达受ABA、NaCl和Cr6+胁迫诱导,推测其在大麦的生长发育和抵抗逆境胁迫过程中发挥重要作用.     

过量表达Trxs对铝胁迫下转基因大麦幼苗根系抗氧化酶系的影响

为了解硫氧还蛋白的过量表达对提高植物抗铝毒能力的作用,以过量表达硫氧还蛋白S基因(Trxs)的转基因大麦为材料,采用水培法研究0.05 mmol/L AlCl3胁迫条件下转基因大麦株系(LSY-11-1-1)幼苗根系谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化酶活性的变化,以及蛋白质和膜脂氧化损伤程度.结果表明,(1)在0.05 mmol/L AlCl3处理下,大麦幼苗根中蛋白质羰基含量和丙二醛含量显著高于非胁迫处理样品,但是转基因大麦的蛋白质羰基含量和丙二醛含量显著低于非转基因对照,如在铝胁迫处理的6、24、48、72和96 h时转基因大麦幼苗根中蛋白羰基含量分别只有对照的68.13%、52.39%、56.18%、58.02%和60.48%,MDA含量分别是对照的71.26%、74.47%、83.05%、73.65%与75.31%.(2)胁迫处理下大麦根系GSH-PX、CAT和APX等抗氧化酶活性出现不同程度的增加;与非转基因对照相比,转基因大麦幼苗根系抗氧化酶系的活性普遍高于对照,如GSH-PX活性在处理的3、24、48、72和96 h时分别是对照的1.1、1.2、1.8、1.6和1.6倍;APX在活性高峰时分别是对照的121%(3h)和119%(96 h);CAT活性在胁迫处理的3、12、24、48和72 h分别比对照提高了62%、11%、7%、34%和17%,而且转基因幼苗根系CAT活性高峰(处理3 h)比对照提前出现21 h(处理24 h)出现.这些结果表明过量表达Trxs可以有效地提高上述抗氧化酶类的活性,缓解铝毒对大麦根系蛋白质和膜脂的氧化损伤,从而提高转基因大麦幼苗对铝胁迫的抗性.