充分利用湖洲进一步发展洞庭湖区芦苇生产的探讨

洞庭湖区种植的荻苇(Miscanthus sacchariflorus)和卡开芦(Phragmites karka),常通称为芦苇。共有面积85万亩,占全国芦苇面积的8.5％。总产58万吨,占全国总产的39.5％。单产0.68吨,为全国平均单产的4.1倍。丰产田单产高达2.35吨。是国内外著名的芦苇高产地区。并拥有世界上所特有的大面积高产优质的荻苇,成为我国不可多得的造纸原料基地,被誉为世界芦苇生产“王国”。     

苏云金芽孢杆菌4.0718菌株晶体毒素性质的研究

以苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）4．0718菌株伴孢晶体65kD原毒素为材料，比较了几种染色-脱色方法对电洗脱回收蛋白的影响。蛋白纯化的步骤包括SDS-PAGE分离、采用自制蛋白回收装置电洗脱回收杀虫晶体蛋白及抗胰蛋白酶核心多肽、超滤法脱盐、冷丙酮沉淀法除去考马斯亮蓝及SDS。经SDS—PAGE检测，呈现出均一的蛋白带，回收蛋白达到了电泳纯。以双向凝胶电泳（2-DE）技术分析了苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD—1和4．0718菌株伴孢晶体内的蛋白质组分。结果表明，两者相互匹配的蛋白点有54个，HD—1菌株的130kD亚基有2个点，其等电点在5．25～5．75之间，65kD亚基在等电点3．4～8．3之间具有广泛的分布，130与65kD之间的亚基的等电点集中在3．5～4．2之间，65kD以下亚基的等电点集中在3．5～6．2之间；4．0718菌株的130kD亚基仅有1个点，65kD亚基的蛋白点比HD-1菌株更多，130与65kD之间的亚基、65kD以下的亚基蛋白点均比HD-1菌株多且等电点分布范围更广。     

Bt营养期杀虫蛋白Vip3及其作用受体的研究进展

营养期杀虫蛋白Vip3是苏云金芽胞杆菌在对数生长中期开始分泌表达的一类对鳞翅目害虫具有广谱杀虫活性的蛋白质,它与已知的杀虫晶体蛋白相似性很低。本文主要从Vip3基因的挖掘,Vip3蛋白的特性、作用受体及其应用等方面作简要综述。     

一种纯化苏云金杆菌Cry1Ac蛋白的方法

Cry蛋白的纯化技术在很大程度上制约了其结构与功能的研究.为此,提出了一种以等电点沉淀方法纯化苏云金杆菌Cry1Ac的原毒素,用分子筛层析纯化其活性毒素的方法.结果表明:Cry1Ac的原毒素在pH值5.05条件下沉淀纯化效果好;以纯化的原毒素激活进行分子筛层析,收集其最大峰便可获得较高浓度的活性毒素;该方法不仅纯化效果...     

环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响

【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白（cyclic AMP receptor protein,Crp）基因在刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因（crp）,通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-P_ermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子P_ermE的控制下;PCR扩增P_ermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将P_ermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-P_ermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-P_ermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-P_ermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-P_ermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S. spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S. spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S. spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S. spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S. spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S. spinosa-1。扫描电子显微镜结果显示工程菌株菌丝片段化程度较高,分支较少,有利于提高工程菌株S摇瓶发酵结果表明,工程菌株中的多杀菌素产量与对照菌株相比提高了128%。. spinosa-Crp发酵过程中的溶氧水平。【结论】crp的过量表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长产生一定影响,并有效促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成,为通过其他正调控基因的超量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了基础。     

GlnA基因对刺糖多孢菌生长发育及多杀菌素合成的影响

谷氨酰胺合成酶（GS，glutamine synthetase）是由GlnA基因编码的生物体中最古老也是最广泛存在的酶，它参与许多生物体中的氮和碳代谢，是生物体氮代谢的关键酶之一，对微生物的生命活动起着重要作用。本文研究了GlnA基因对刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa的生长发育及次级代谢产物合成的影响，从刺糖多孢菌基因组中克隆了glnA 基因的部分片段，将其与穿梭载体pOJ260连接，构建敲除载体pOJ260-glnA，通过接合转移将其导入刺糖多孢菌野生菌中，获得刺糖多孢菌敲除菌株S.spinosa-△glnA；同时，利用重叠延伸PCR将glnA基因置于红霉素强启动子P_ermE下，并将融合片段P_ermE-glnA与穿梭载体pOJ260进行酶切酶连，构建过量表达载体pOJ260-P_ermE-glnA，通过接合转移将其导入刺糖多孢菌中，获得了刺糖多孢菌过量表达菌株S.spinosa-glnA。表型分析发现，glnA基因的敲除对刺糖多孢菌的菌丝形态、孢子萌发等方面都有显著的抑制作用。HPLC检测分析发现，过量表达菌株中多杀菌素产量相比原始菌株提高到170%；该研究表明glnA基因对刺糖多孢菌的生长发育与多杀菌素的合成有一定的影响，为研究其在链霉菌次级代谢过程中的作用奠定了重要基础。     

患病草鱼肠道病原菌的分离鉴定及毒力研究

自环洞庭湖区精养鱼池患病草鱼肠道中分离获得4种病原菌,进行16S rRNA基因和gyrB基因序列测定和在线比对,并对草鱼进行回归感染。随后进行4种病原菌的药敏特征、溶血活性试验,并利用PCR方法检测了6种毒力因子的携带情况。试验结果表明,病原菌分别为温和气单胞菌、异常嗜糖气单胞菌、类志贺邻单胞菌和格氏乳球菌;4种病原菌回归感染草鱼,均能使草鱼患病致死,自死亡的草鱼体内均能分离得到相应感染的病原菌;4种病原菌对多种抗生素具有耐药性,且在脱纤维绵羊血血平板上检测到了温和气单胞菌、异常嗜糖气单胞菌AaB007的溶血活性;PCR结果表明,4种病原菌携带多种毒力因子。研究结果可为环洞庭湖区草鱼精养鱼池健康养殖及病害防治提供科学依据。     

对根结线虫高毒力芽胞杆菌的鉴定及其活性测定

为筛选高效安全的杀虫资源,从海底淤泥中分离到一株对根结线虫(Meloidogyne spp.)高毒力的芽胞杆菌YBf-10,PCR扩增16S rRAN基因,经测序、序列比对分析和系统进化树构建,发现其与坚强芽胞杆菌(Bacillus firmus)Z1-7菌株16S rDNA同源性为99%,初步确定所分离的菌株为坚强芽胞杆菌。将该菌株培养至芽胞成熟,离心取上清,10倍稀释后进行生物测定,发现其对北方根结线虫二龄幼虫有很高的毒力。处理24h校正死亡率达到50%以上,72h达到100%。对根结线虫虫卵进行毒力测定表明,作用48h后能显著抑制虫卵孵化达到80%以上。在培养过程中分不同时段取样,并用所取样品上清进行生物测定,发现从稳定期开始表现出了对北方根结线虫的毒力,在整个稳定期毒力持续增强,直到衰亡期后期,毒力达到最高,表明坚强芽胞杆菌所产生的杀线虫活性物质主要是在稳定期合成的。将发酵上清80℃处理30min毒力无明显变化,通过饱和硫酸铵沉淀上清中蛋白,该蛋白对线虫无明显毒力,但是去蛋白后的上清对线虫仍然具有与未经处理上清相似的杀线虫活性,表明坚强芽胞杆菌产生的杀线虫活性物质是一种非蛋白类的小分子化合物。研究结果提示,本研究所分离的坚强芽胞杆菌在稳定期能够大量合成对线虫具有毒杀活性的小分子化合物,对根结线虫表现出极高毒力,为利用该菌株开发植物寄生线虫生防制剂提供了杀虫资源。