禾谷镰孢菌β2-微管蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

【目的】在大肠杆菌中表达禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）的β2-微管蛋白,筛选使β2-微管蛋白可溶性表达的诱导因子,并对可溶性蛋白进行纯化。【方法】以构建好的质粒（pET32a+-β2-tubulin）为模板,PCR扩增出β2-微管蛋白基因,将其克隆到pET30a+表达载体上,并转化到表达宿主菌BL21(DE3)及Rossatta（DE3）pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达,并筛选蛋白可溶性表达的诱导因子;对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot验证。【结果】获得了在大肠杆菌中表达效率高的阳性克隆;为了克服常规诱导条件下表达的β2-微管蛋白主要以包涵体形式存在的问题,通过对诱导温度、时间、诱导物浓度、初始诱导时的菌液浓度、培养液及宿主菌等六因子的综合分析,获得了β2-微管蛋白可溶性表达的优化条件;利用HisTrap HP预装柱对β2-微管蛋白进行纯化,可获得纯度很高的可溶性β2-微管蛋白;SDS-PAGE确认表达出的融合蛋白分子量为51.6 kD;Western blot证实表达的融合蛋白能与6×His及β-微管蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。【结论】本研究为外源基因在大肠杆菌中的可溶性表达提供了参考;获得的微管蛋白为研究微管蛋白靶标类药物的抗性机制以及生产中开发新的以微管蛋白为靶标的杀菌剂提供了物质基础。     

柑桔溃疡病菌抗药突变体的生理特性研究

 经药剂驯化和紫外光诱导双重作用可获得柑桔溃疡病菌抗拌种灵突变体(XcR),病原菌抗药突变频率低于10-6。Xc R的生长速率与敏感菌株基本一致,对萎锈灵和叶枯唑具有潜在的正交互抗性,与浸种灵没有交互抗性。XcR胞外产物和胞外水解酶活性一般多于或高于敏感菌株,其中以淀粉酶活性变化最为明显。Xc R琥珀酸脱氢酶活性显著降低,并对拌种灵的敏感性亦降低。XcR能够引起烟草的过敏性反应,但失去对寄主的致病性。Xc R的性质表明,柑桔溃疡病菌对拌种灵产生抗药性的风险较低,病原菌获得抗药性状的同时可能导致其在田间的适合度下降。琥珀酸脱氢酶的活性可作为柑桔溃疡病菌抗药性的标记。     

植物病原真菌对甲基立枯磷的抗药性及风险研究

通过对人工获得的抗甲基立枯磷菌株的抗药水平、在培养基上的生长速度、致病力、对其它杀菌剂的敏感性测定以及对菌核的观察和用药条件等方面分析, 在实验室内进行了植物病原真菌对甲基立枯磷的抗药性风险研究。结果显示, 不同的病原菌具有不同的抗药性。抗甲基立枯磷的水稻纹枯病菌菌株对甲基立枯磷的抗药性较强、抗药性风险大; 小麦纹枯病菌和油菜菌核病菌抗药菌株抗药性较弱、风险小。抗甲基立枯磷的水稻纹枯病菌对菌核净具有高水平正交互抗性; 抗甲基立枯磷的小麦纹枯病菌对菌核净和扑海因有中等程度正交互抗性; 这两种真菌的抗药菌株对五氯硝基苯的正交互抗性弱, 对烯唑醇和异稻瘟净没有交互抗性。甲基立枯磷与二甲酰亚氨类和芳烃类杀菌剂具有相似的抑菌作用。     

嘧菌酯对黄瓜霜霉病菌孢子发育特性的影响及其防治效果研究

嘧菌酯是一种高效广谱的甲氧丙烯酸酯类杀菌剂,对黄瓜霜霉病有着很好的防治效果。研究其生物学作用方式对田间防治黄瓜霜霉病具有重要的指导意义。本研究主要就嘧菌酯对黄瓜霜霉病病原菌游动孢子的释放、裂解及游动的影响进行试验分析,结果表明,嘧菌酯具有良好的抑菌和杀菌活性,能显著抑制黄瓜霜霉病菌孢子囊游动孢子的释放,并在短时间内使游动孢子停止游动,甚至引起游动孢子裂解。室内叶片活体接种试验表明,嘧菌酯对黄瓜霜霉病菌孢子囊的产生也有强烈的抑制作用,接种病菌3 d后用5μg/m l的嘧菌酯处理,抑制率达96.65%。植株活体接种试验中,嘧菌酯对黄瓜霜霉病表现优异的预防效果,但治疗效果较差。     

枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的生物功能分析

采用AKTA-epxlore层析系统,利用DEAE sepharose fast flow、Phenyl sepharose 6 F.F.和羟基磷石灰石柱层析后,分离纯化获得枯草芽孢杆菌Bs-916抗菌蛋白质Bacisubin.该蛋白质对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisease)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、白菜黑斑病菌(Alternaria oleracea)、甘蓝黑斑病菌(A. Brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici (syd.) Butl.)和水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme Sheld)均有抑菌活性,尤其对Alternaria属的病原菌具有较高的毒力.枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的抑菌机制是造成病原菌菌丝营养吸收困难,致使菌丝顶端膨大,分支增加,胞壁加厚、断裂,从而抑制了病原菌的生长.研究发现抗菌蛋白具有凝集素活性和核糖核酸酶活性,无蛋白酶活性和蛋白酶抑制活性.     

枯草芽孢杆菌生防菌株NJ-18的发酵条件优化

通过单因子试验筛选到了适合枯草芽孢杆菌NJ-18生防菌株生长及其拮抗物质产生的最佳碳源为玉米粉和麦芽糖,最佳氮源为豆粕,最佳金属离子是Ca2+。用正交试验法确定了该培养基各组分的最佳含量为:玉米粉10g.L-1、麦芽糖30g.L-1、豆粕30g.L-1、CaCO31.5g.L-1;在确定适合该菌株的培养基组分基础上,对其培养条件进行优化试验,结果表明:初始pH为6.8、培养温度为28℃、250mL摇瓶装液量为90mL、接种量为2%(体积分数)、培养时间为36h、转速为180r.min-1时为该菌株的最佳培养条件。     

辣椒疫病生物防治菌株的筛选与定殖

从辣椒田、番茄田、林地土壤中分离、筛选拮抗辣椒疫霉的微生物,对拮抗作用较强的菌株的抗菌持久力及抗菌谱进行测定,并对拮抗作用较强的细菌菌株B100、B148在辣椒根部的定植情况进行探讨。结果表明:①在辣椒田、番茄田土样的真菌分离物中,拮抗菌株的比例最高,分别占真菌分离物的40%和45%,而林地土样中,拮抗细菌与真菌的比例接近,分别为21．28%和28．16%。②放线菌中以A001菌株对辣椒疫霉的作用最强,抑菌带宽达22．7 mm,生长抑制率达92．9%,拮抗持久力可达20 d,对其他6种病原菌的作用也较强;细菌中B100菌株抑制能力最好,对7种植物病原菌的抑菌带宽为11．3～18．5 mm,生长抑制率为50．0%～84．3%;在盆栽试验中,B148、B214对辣椒疫病的防治效果最好,分别达99．38%和97．88%。③B100可在辣椒根部稳定定殖,处理后20 d根部的菌量仍达7．06×10~5cfu·g~(-1)(根重),而B148的定殖能力则明显差于B100。     

稻梨孢抗嘧菌酯突变体B9-R2的部分生物学性状

通过紫外诱变获得引起稻瘟病的稻梨孢抗嘧菌酯突变体B9 R2, 此突变体对嘧菌酯表现为高抗药水平。B9 R2的40个单孢子后代的抗药性状稳定, 但是随着在无药平板上转代和低温培养, 抗药水平和生长速率均下降, 第 10代的抗药水平和生长速率分别下降 22 6%和 39 6%; 4℃培养 30d后, 抗药水平和生长速率分别下降 19 1%和 29 4%。与野生亲本菌株B9相比, 抗药突变体产孢量和孢子萌发率分别下降 65 8%和 12 9%。B9 R2的黑色素产生能力和致病力与亲本B9菌株相同。嘧菌酯不抑制抗药突变体B9 R2黑色素的产生, 但能强烈抑制孢子的产生, 在 100μg·mL-1嘧菌酯的产孢培养基上其产孢量下降了 93 2%。盆钵试验表明, 在活体条件下突变体B9 R2对嘧菌酯也具有抗药性。     

抗氰烯菌酯的禾谷镰刀菌nit突变体的诱导及其生物学特性

【目的】研究抗氰烯菌酯的禾谷镰刀菌nit突变体的生物学特性。【方法】将3个抗氰烯菌酯的禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schw.）菌株分别在含氯酸盐的MMC培养基上培养，共获得了50个硝酸盐利用缺陷突变体(nit)。比较了抗性菌株的nit突变体与亲本在无性和有性阶段的主要生物学性状。【结果】抗性菌株的nit突变体与亲本在菌落生长速率、培养性状和致病性方面没有显著差异；但某些突变体中，产孢量和产子囊壳能力方面存在一定差异。此外，禾谷镰刀菌对氯酸盐和氰烯菌酯之间没有交互抗药性，且抗性可以稳定遗传。【结论】可以将nit作为遗传标记来研究禾谷镰刀菌对氰烯菌酯的抗药性遗传学。