猪链球菌2型及其毒力因子检测多重PCR的建立与应用

根据相关文献设计并合成引物，建立了能同时检测猪链球菌2型（cps）及其重要毒力因子溶菌酶释放蛋白（mrp）和细胞外因子（epf）的多重PCR方法。目的片段的大小分别为885bp（mrp）、675bp（cps）和443bp（epf）。对参考菌株、人工攻毒病料和临床收集病料的检测结果显示，该多重PCR特异性强、敏感性高，可直接从临床病料中检测出猪链球菌2型，并能鉴定其毒力因子表型。     

兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果

用RT—PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白VP60基因,通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid—VP60,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV—Bac—VP60,经RT—PCR、IFA、SDS-PAGE、Western blotting、HA和HI鉴定,结果显示重组VP60蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达。在不加任何佐剂的情况下,用表达的蛋白免疫3月龄非RHD免疫兔,结果显示,免疫后21天,兔体内可产生抗RHDV抗体,抗体血凝抑制效价为2^6～2^7,该抗体可以抵抗血凝效价为2^10致死剂量RHDV强毒的攻击,本研究为兔病毒性出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪链球菌2型的致病特性与毒力因子

介绍了猪链球菌２型对猪人、人、其他动物及实验动物的致病特性;概述了猪链球菌溶菌酶释放蛋白（ＭＲＰ）、细胞外蛋白因子（ＥＦ）、溶血素、英膜多糖、４４ｋｂ蛋白和ＩｇＧ结合蛋白及纤毛、粘着素等毒力因子的研究概况。     

猪链球菌2型的PCR快速检测

根据猪链球菌 2型的荚膜多糖抗原基因 cps2 J,合成 1对可扩增长度为 6 75 bp目的片段的引物 ,建立了检测猪链球菌 2型的 PCR法。应用 PCR对 9株经玻片凝集试验检测为猪链球菌 2型的菌株进行了检测 ,均呈阳性 ;而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等检测结果均呈阴性 ,表明了本方法的特异性。用此法对 88份正常猪的扁桃体样品的细菌分离物进行了检测 ,36份呈阳性 ,同时用玻片凝集试验进行对照检测 ,也全部呈阳性。而此法不需进行细菌的纯分离培养 ,即可用于猪链球菌 2型的快速诊断以及流行病学调查。     

应用多重RT-PCR方法检测158例猪粪样中的两种冠状病毒

根据GenBank上发表的猪流行性腹泻（PEDV）和猪传染性胃肠炎（TGEV）基因序列，针对其PEDVM（膜蛋白）基因保守区及TGEV的S基因（纤突蛋白基因）5’端保守区，各设计一对引物，可特异扩增出目的条带大小分别为467bp和1062bp。用上述两对引物对同一样品中的PEDV和TGEV可进行鉴别检测，对猪的其它病毒和细菌的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明：该双重PCR方法能检出PEDV1pg、TGEV0．1pg的模板。同时采用建立的多重RT-PCR及韩国引进的PEDV和TGEV病毒抗原快速诊断试剂盒检测结果显示：此多重RT-PCR方法特异性强，且较快速试剂盒更加敏感。应用多重RT-PCR对158份临床猪粪样的检测结果表明：我国很多猪场普遍存在TGEV和PEDV，尤其以PEDV污染更为严重，感染率达53．2％，但双重感染率较低，仅为4，4％。     

我国苏皖地区PRRSV Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析

为了分析2009年安徽省和江苏省周边地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的遗传变异特征,采用RT—PCR方法对该地区分离的22株PRRSV的Nsp2和ORF5基因进行了扩增、克隆和测序,并进行序列分析。结果表明：22株PRRSV均属于美洲型毒株,其中21个毒株的Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征;而且此21个毒株的ORF5基因推导的氨基酸序列也发生多处突变,集中出现在毒力相关位点、抗原表位和糖基化位点序列中。只有HZNJ株与疫苗株的同源性较高。进化树分析显示,21个分离株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,而HZNJ株与疫苗毒株有较近的亲缘关系,进一步说明高致病性PRRSV已成为该地区的优势流行毒株。     

应用琼脂扩散试验检测盱眙水牛病抗体的探讨

以盱眙水牛病自然发病牛或人工感染传代病牛后期血清与病牛肝、淋巴结组织匀浆提取物进行琼脂扩散试验.结果.以病牛肝、淋巴结、脾混合提取物为抗原对该病后期血清可产生沉淀反应(10/13).取其中2头阳性病牛血清作为特异性抗体,对7头病水牛肝、脾、淋巴结混合悬液起反应;对另1头病水牛肝、淋巴结组织分别起反应;对该牛的脾组织不发生反应.     

快速ELISA技术检测轮状病毒抗原试验报告

轮状病毒(RV)是引起婴幼儿和多种幼龄动物腹泻的主要病原之一。RV病的诊断主要依赖于粪便中病毒粒子或抗原成分的检出。通常的方法有电镜或免疫电镜、ELISA及核酸SDS-PAGE等,这些方法有的比较繁琐,需要昂贵的设备,有的需要较长的时间,不能适应临床快速诊断的要求。为此,我们建立了一种快速双抗体夹心ELISA技术,能在40分钟内检出粪便中的轮状病毒,获得较为满意的结果。 材料与方法     

鸡传染性法氏囊病分子流行病学研究

15个江苏省IBDV分离株，对其VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序，得到约560bp长的片段。分析比较15个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区(AccI-SpeI)推断的氨基酸序列，构建进化树。氨基酸序列分析以及进化树分析表明，15个IBDV分离株是超强毒株。而且目前vvIBDVs在亚洲各个国家流行，且与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。     

肝片吸虫Fh8标签融合表达口蹄疫O型病毒结构蛋白

口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)的结构蛋白VP1难以实现体外的高效表达。本研究为获得良好免疫原性的VP1蛋白,选用肝片吸虫Fh8小肽段作为新型融合表达标签,构建重组Fh8-VP1免疫原,以期获得大肠杆菌中的高效表达。分别合成VP1的20~40aa和129~169aa之间的核苷酸片段,并用2个甘氨酸(GG)连接2个片段,合成的核苷酸片段(ΔVP1)克隆入Fh8标签之后,构建重组菌BL21(DE3)/pColdⅠ-Fh8-ΔVP1,SDSPAGE分析蛋白表达形式,Western blot方法检测重组His-Fh8-ΔVP1的抗原性。结果显示,成功构建重组质粒BL21(DE3)/pColdⅠ-Fh8-ΔVP1,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,且以包涵体形式存在于菌体蛋白,可与猪源FMDV阳性血清发生特异性反应。