SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子 P1的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 法,用于 P1 的早期诊断.以感染 P1 的猪血清DNA提取物为模板,采用 PCR 扩增 P1 101 bp 的基因片段,将其克隆至 pMD18-T 载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.经测序证实扩增片段属于 P1,所建立的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 的反应在 101 ～108拷贝/μL 之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异.成功建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 载量的方法,为 P1 致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台.     

非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对O型口蹄疫病毒的佐剂效果

【目的】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)的传染性强,传播广,给世界经济和社会发展带来巨大危害,目前疫苗接种仍是主要而有效的防控手段。以增强口蹄疫疫苗免疫效力为目的,基于国内外对鞭毛蛋白佐剂的深入了解与研究,对非致病性大肠杆菌鞭毛进行修饰,研究鞭毛蛋白(flagellin,F)以及有无LTMT佐剂不同重组鞭毛蛋白对口蹄疫病毒(foot and mouth disease virse,FMDV)的佐剂作用。【方法】通过体外表达获得pCold-F0、pCold-F0-LTMT、pCold-F0NC、pCold-F0NC-LTMT 4种不同重组鞭毛蛋白,用间接ELISA方法检测pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT蛋白的生物学活性,按照5μg/只小鼠蛋白量与FMDV灭活抗原混合制备疫苗,同时设置添加或者不添加ISA 206佐剂组,皮下接种Balb/c小鼠,共免疫2次,每次间隔2周。分别于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d采血并采集小鼠粪便,45 d后取小肠后段,采用阻断ELISA方法检测血清IgG抗体滴度,用间接ELISA方法检测小鼠粪便和肠洗液中特异的分泌性IgA(secretory IgA,SIgA)抗体滴度,以评估免疫效力。【结果】SDS-PAGE和Western blot分析表明,4种不同重组鞭毛蛋白成功表达。并用GM l-ELISA方法验证了pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT的生物学活性,融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT保留了与GM l结合能力。动物试验结果表明,疫苗经皮下注射接种后,单独口蹄疫抗原组没有产生明显的抗体水平,而鞭毛蛋白佐剂组比单独的口蹄疫抗原组,IgG滴度高,并且产生sIgA抗体滴度更早、更高。此外,LTMT与鞭毛蛋白协同作用能刺激小鼠机体产生更高的IgG和sIgA。在试验中,当鞭毛蛋白与ISA 206佐剂联合使用时,血清中IgG滴度大幅增高,且抗体持续期延长。口蹄疫抗原与ISA 206佐剂和F0NC-LTMT混合使用效果最佳,显示对FMDV的最好保护。【结论】数据表明,黏膜佐剂F0-LTMT发挥双重佐剂活性,皮下注射可显著提高FMDV全身特异性IgG和局部sIgA水平,显示其具有良好的应用前景。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）S蛋白基因5'端包含 B、C抗原位点的1.0 kb DNA片段,并与穿梭载体pShuttle-CMV连接;然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化,获得了1株含有TGEV S蛋白5'端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay, IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后,病毒效价稳定,滴度平均为107. 7TCID50/mL。动物免疫试验显示, rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。     

鸡传染性法氏囊病分子流行病学研究

15个江苏省IBDV分离株,对其VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序,得到约560bp长的片段。分析比较15个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区(AccI-SpeI)推断的氨基酸序列,构建进化树。氨基酸序列分析以及进化树分析表明,15个IBDV分离株是超强毒株。而且目前vvIBDVs在亚洲各个国家流行,且与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。     

SYBR Green I实时定量PCR方法检测2型猪圆环病毒

利用PCR技术扩增出2型猪圆环病毒(PCV)ORF2保守区基因107 bp片段,并克隆到pMD-19-T载体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行荧光定量PCR,并绘制标准曲线。再以提取的PCV-2、PCV-1、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR检测。结果表明:建立的实时定量PCR方法,起始模板浓度与样本阈值循环数(Ct)值之间呈很好的线性关系,标准曲线斜率为-0.32,相关系数r2为0.997,Ct值为11.9~26.9。PCV-2能扩出S型荧光曲线,熔解曲线的峰狭窄单一,而PCV-1、PPV和PRV均不能扩出。对32份健康猪和32份断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)可疑猪样品定量检测:健康猪阳性率为44%(14/32),病毒载量均小于104拷贝.μL-1;PMWS可疑猪阳性率96.8%(31/32),病毒载量均大于105拷贝.μL-1。实时荧光定量PCR方法可用于2型猪圆环病毒定性及定量的检测。     

PCR定量方法概述

聚合酶链式反应(Polynlerase Chain Reaction,PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。PCR技术自诞生之日起就决定了它不仅是一种检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行定量分析的有力工具。     

仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗制苗株的生物学特性

对仔猪大肠杆菌病K88^-( 为黏附素阳性)、K99^-、987P^-、F41^-制苗株的血凝性、传代稳定性等生物学特性进行了研究。结果表明。K88^-株不能凝集绵羊红细胞，但能凝集鸡、猪、豚鼠、兔红细胞，以鸡红细胞凝集价最高；K99^-株不能凝集兔红细胞，但能凝集鸡、猪、豚鼠、绵羊红细胞，以绵羊红细胞凝集价最高；F41^-株对这5种红细胞均能凝集．以绵羊红细胞凝集价最高；而987P^-株对这5种红细胞均不能凝集。传代结果表明。K88^-株使用限定代次可达22代，K99^-、987P^-、F41^-至少可达42代。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测及其序列分析

根据猪链球菌2型的溶血素基因合成了一对可扩增长度为1496bP目的片段的引物，建立了检测溶血素基因的PCR方法。该方法对猪链球菌2型参考株SS2—N株的检测结果为阳性，对马链球菌善疫亚种(C群)参考株ATCC35246、分离株SESZ—Y、SESZ—T、SESZ—C和猪葡萄球菌、大肠埃希氏茵的检到结果均为阴性；用EcoR I内切酶进行酶切．获得了与预期结果一致的863bP和633bP的2个片段。经对SS2—1株的PCR产物进行测序及序列分析，表明其与1933株、P1／7株的核苷酸同源性分别为99．7％和100％。     

IBDV不同分离株VP2高变区的基因序列分析

对9个IBDV(传染性法氏囊病毒)分离株的、VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序，得到约560bp长的片段分析比较9个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区（Aeel-Spell)的氨基酸序列，并构建进化树、结果表明，9个IBDV分离株是超强毒株，并且得出亚洲目前流行的、rvIBDVs与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。