非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对O型口蹄疫病毒的佐剂效果

【目的】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)的传染性强,传播广,给世界经济和社会发展带来巨大危害,目前疫苗接种仍是主要而有效的防控手段。以增强口蹄疫疫苗免疫效力为目的,基于国内外对鞭毛蛋白佐剂的深入了解与研究,对非致病性大肠杆菌鞭毛进行修饰,研究鞭毛蛋白(flagellin,F)以及有无LTMT佐剂不同重组鞭毛蛋白对口蹄疫病毒(foot and mouth disease virse,FMDV)的佐剂作用。【方法】通过体外表达获得pCold-F0、pCold-F0-LTMT、pCold-F0NC、pCold-F0NC-LTMT 4种不同重组鞭毛蛋白,用间接ELISA方法检测pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT蛋白的生物学活性,按照5μg/只小鼠蛋白量与FMDV灭活抗原混合制备疫苗,同时设置添加或者不添加ISA 206佐剂组,皮下接种Balb/c小鼠,共免疫2次,每次间隔2周。分别于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d采血并采集小鼠粪便,45 d后取小肠后段,采用阻断ELISA方法检测血清IgG抗体滴度,用间接ELISA方法检测小鼠粪便和肠洗液中特异的分泌性IgA(secretory IgA,SIgA)抗体滴度,以评估免疫效力。【结果】SDS-PAGE和Western blot分析表明,4种不同重组鞭毛蛋白成功表达。并用GM l-ELISA方法验证了pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT的生物学活性,融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT保留了与GM l结合能力。动物试验结果表明,疫苗经皮下注射接种后,单独口蹄疫抗原组没有产生明显的抗体水平,而鞭毛蛋白佐剂组比单独的口蹄疫抗原组,IgG滴度高,并且产生sIgA抗体滴度更早、更高。此外,LTMT与鞭毛蛋白协同作用能刺激小鼠机体产生更高的IgG和sIgA。在试验中,当鞭毛蛋白与ISA 206佐剂联合使用时,血清中IgG滴度大幅增高,且抗体持续期延长。口蹄疫抗原与ISA 206佐剂和F0NC-LTMT混合使用效果最佳,显示对FMDV的最好保护。【结论】数据表明,黏膜佐剂F0-LTMT发挥双重佐剂活性,皮下注射可显著提高FMDV全身特异性IgG和局部sIgA水平,显示其具有良好的应用前景。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）S蛋白基因5'端包含 B、C抗原位点的1.0 kb DNA片段,并与穿梭载体pShuttle-CMV连接;然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化,获得了1株含有TGEV S蛋白5'端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay, IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后,病毒效价稳定,滴度平均为107. 7TCID50/mL。动物免疫试验显示, rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。     

鸡传染性法氏囊病分子流行病学研究

15个江苏省IBDV分离株,对其VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序,得到约560bp长的片段。分析比较15个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区(AccI-SpeI)推断的氨基酸序列,构建进化树。氨基酸序列分析以及进化树分析表明,15个IBDV分离株是超强毒株。而且目前vvIBDVs在亚洲各个国家流行,且与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。     

PCR定量方法概述

聚合酶链式反应(Polynlerase Chain Reaction,PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。PCR技术自诞生之日起就决定了它不仅是一种检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行定量分析的有力工具。     

仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗制苗株的生物学特性

对仔猪大肠杆菌病K88^-( 为黏附素阳性)、K99^-、987P^-、F41^-制苗株的血凝性、传代稳定性等生物学特性进行了研究。结果表明。K88^-株不能凝集绵羊红细胞，但能凝集鸡、猪、豚鼠、兔红细胞，以鸡红细胞凝集价最高；K99^-株不能凝集兔红细胞，但能凝集鸡、猪、豚鼠、绵羊红细胞，以绵羊红细胞凝集价最高；F41^-株对这5种红细胞均能凝集．以绵羊红细胞凝集价最高；而987P^-株对这5种红细胞均不能凝集。传代结果表明。K88^-株使用限定代次可达22代，K99^-、987P^-、F41^-至少可达42代。     

SYBR Green I实时定量PCR方法检测2型猪圆环病毒

利用PCR技术扩增出2型猪圆环病毒(PCV)ORF2保守区基因107 bp片段,并克隆到pMD-19-T载体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行荧光定量PCR,并绘制标准曲线。再以提取的PCV-2、PCV-1、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR检测。结果表明:建立的实时定量PCR方法,起始模板浓度与样本阈值循环数(Ct)值之间呈很好的线性关系,标准曲线斜率为-0.32,相关系数r2为0.997,Ct值为11.9~26.9。PCV-2能扩出S型荧光曲线,熔解曲线的峰狭窄单一,而PCV-1、PPV和PRV均不能扩出。对32份健康猪和32份断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)可疑猪样品定量检测:健康猪阳性率为44%(14/32),病毒载量均小于104拷贝.μL-1;PMWS可疑猪阳性率96.8%(31/32),病毒载量均大于105拷贝.μL-1。实时荧光定量PCR方法可用于2型猪圆环病毒定性及定量的检测。     

兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果

用RT—PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白VP60基因,通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid—VP60,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV—Bac—VP60,经RT—PCR、IFA、SDS-PAGE、Western blotting、HA和HI鉴定,结果显示重组VP60蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达。在不加任何佐剂的情况下,用表达的蛋白免疫3月龄非RHD免疫兔,结果显示,免疫后21天,兔体内可产生抗RHDV抗体,抗体血凝抑制效价为2^6～2^7,该抗体可以抵抗血凝效价为2^10致死剂量RHDV强毒的攻击,本研究为兔病毒性出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

我国苏皖地区PRRSV Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析

为了分析2009年安徽省和江苏省周边地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的遗传变异特征,采用RT—PCR方法对该地区分离的22株PRRSV的Nsp2和ORF5基因进行了扩增、克隆和测序,并进行序列分析。结果表明：22株PRRSV均属于美洲型毒株,其中21个毒株的Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征;而且此21个毒株的ORF5基因推导的氨基酸序列也发生多处突变,集中出现在毒力相关位点、抗原表位和糖基化位点序列中。只有HZNJ株与疫苗株的同源性较高。进化树分析显示,21个分离株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,而HZNJ株与疫苗毒株有较近的亲缘关系,进一步说明高致病性PRRSV已成为该地区的优势流行毒株。     

猪链球菌2型的致病特性与毒力因子

介绍了猪链球菌２型对猪人、人、其他动物及实验动物的致病特性;概述了猪链球菌溶菌酶释放蛋白（ＭＲＰ）、细胞外蛋白因子（ＥＦ）、溶血素、英膜多糖、４４ｋｂ蛋白和ＩｇＧ结合蛋白及纤毛、粘着素等毒力因子的研究概况。