猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备及攻毒保护研究

为研究现用猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777疫苗毒株对流行毒株的免疫保护效果,以RTPCR进行PEDV CV777疫苗株、JS12流行株S基因克隆测序,进行PEDV S基因核酸序列分析与氨基酸序列分析。分别以转瓶工艺与细胞悬浮培养工艺培养Vero E6细胞,制备PEDV CV777株转瓶灭活苗与悬浮灭活苗。分别以PEDV转瓶灭活苗、悬浮灭活苗、PEDV流行株组织灭活苗(JS12株)产前30d免疫经产母猪;母猪产仔后14d进行仔猪攻毒保护试验。核酸序列分析显示,PEDV CV777株S基因与流行毒株的相似性在96.4%~99.7%之间,氨基酸序列相似性在96.7%~99.5%之间。转瓶工艺制备PEDV抗原效价为107.0 TCID50/mL,悬浮培养制备PEDV抗原效价为108.5 TCID50/mL。攻毒保护试验显示,悬浮灭活苗免疫母猪后,仔猪有2/10发病,保护率为8/10,转瓶灭活苗组发病率为8/10,保护率仅为2/10;组织灭活苗组9/10发病;对照组10头全部发病。该试验证明,提高PEDV CV777株的抗原含量,能够有效提高疫苗对PEDV流行毒株的保护效果。     

云南省种公猪精液中乙型脑炎病毒的监测

应用RT-PCR技术开展云南省种公猪精液中乙型脑炎病毒(JEV)感染监测,进而对阳性样品病毒基因扩增产物进行克隆、测序、比对及系统发育分析。从云南省16个地州797份猪精液中检出JEV阳性样品7份,阳性率0.88%。阳性精液样品中的JEV与基因Ⅰ型毒株PrM基因核苷酸序列同源性为97.5%～98.8%,与其他基因型毒株的同源性介于76.9%～89.8%之间,与疫苗毒株(基因Ⅲ型毒株,S19980008)的同源性为89.1%～89.8%。云南省种公猪精液中JEV属于基因Ⅰ型毒株,与人、猪、蚊虫基因Ⅰ型分离毒株遗传关系密切。     

山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定

本研究旨在通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体.采用PCR方法,克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242 bp的基因片段,以及ORF18～ORF19间1 355 bp的片段.接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂,构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg.然后采用脂质体介导法,将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性.结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7 kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg.该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代,并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同.表明上述区域是GTPV的复制非必需区.     

4株鸭坦布苏病毒包膜蛋白基因的分子进化分析及表达

从规模化养鸭场分离到4株鸭坦布苏病毒,成功克隆了包膜蛋白(E蛋白)基因片段,并对其进行了序列测定、分析和表达.结果表明,E基因全长1 503 bp,编码501个氨基酸,序列高度保守.进化分析显示,鸭坦布苏病毒属蚊媒黄病毒类恩塔亚病毒群,与其他坦布苏病毒及近期发现的BYD病毒关系最近.采用原核表达系统对E基因进行了表达,蛋白大小54 300,主要以包涵体形式存在.随后,对E蛋白外功能区序列和3D结构进行了分析,在已解析结构的黄病毒中与WNV E结构最为相似.研究结果为该病的防控和基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

福建及邻近省份禽源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

本研究收集2007~2013年福建省及邻近省份的疑似禽霍乱病死亡鸡、鸭、鹅,进行细菌分离,PCR进行种和荚膜群的鉴定,琼脂扩散试验鉴定其Heddleston氏耐热菌体抗原型。结果共分离鉴定多杀性巴氏杆菌95株,其中鸭源74株,鸡源17株,鹅源4株。其荚膜群全为A型,1型耐热菌体抗原型占67.4%。与20世纪80年代以来我国已有的报道相同,禽源(不含火鸡)多杀性巴氏杆菌血清型仍然以A:1为主。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗和变异株灭活疫苗的免疫效果评价

分别采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1R致弱毒疫苗株和变异毒株灭活疫苗免疫接种40日龄～45日龄仔猪,免疫接种后4周,用高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN-4变异株强毒攻毒,攻毒后21 d剖检,取主要器官作病理组织学观察和病毒抗原定位.结果显示变异毒株灭活疫苗免疫攻毒后导致的病理变化和病毒抗原分布程度均明显高于CH-1R弱毒疫苗免疫组.免疫病理学研究结果表明CH-1R 弱毒疫苗对HU-4株强毒免疫保护效果好于变异毒株灭活疫苗.     

30株鸡大肠杆菌ESBLs基因型检测及耐药性分析

采用2倍稀释法检测30株鸡大肠杆菌对常见药物耐药性,用表型筛选和确证试验检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)情况,并分别用TEM、SHV和CTX-M等3种通用引物进行PCR扩增以确定其基因型.结果显示23株大肠杆菌为产ESBLs株,占76.7%.PCR扩增表明TEM、CTX-M、SHV阳性率分别为73.9%、43.5%和0%,有7株同时检测出TEM和CTX-M基因(占30.4%),3株未检测出TEM、CTX-M和SHV 3种基因(占13.0%).药敏试验结果显示产ESBLs大肠杆菌对药物的多重耐药性明显比非产酶大肠杆菌严重,产酶菌对氨苄西林和头孢噻呋的耐药率最高,为95.7%,对氨基糖苷类、恩诺沙星和复方新诺明的耐药率均高于78%,氨苄西林和三代头孢与酶抑制剂联用或2种不同种类的药物联用均能明显增强抗菌活性.以上结果表明河南省76.7%的临床分离鸡大肠杆菌为产ESBLs株,其基因型主要是TEM和CTX-M,尚无SHV型,β-内酰胺类与酶抑制剂联用或不同种类药物联用是防治鸡产酶大肠杆菌感染的有效措施之一.     

H5N1禽流感病毒NA基因重组腺病毒表达载体的构建

构建携带有H5N1亚型AIV NA基因的重组腺病毒表达载体,为进一步研究AIV中NA基因在病毒致病过程中的作用及相关诊断试剂的开发提供依据。采用PCR的方法从构建好的包含有H5N1AIV NA基因的pMD-19T-N1质粒中扩增出NA基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-N1与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-N1,将pAdeasyd-N1经pacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有NA基因的腺病毒pAd-N1。结果表明,构建含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-N1和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-N1经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-N1转染HEK293细胞,成功获得腺病毒pAd-N1载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。     

双重放大酶免疫传感器检测鸡白痢鸡伤寒沙门菌

为探求新型鸡白痢鸡伤寒沙门菌快速检测技术,本研究首次利用多壁碳纳米管与离子液体[BMIM] PF6修饰四通道丝网印刷碳电极,制成双重放大信号检测鸡白痢鸡伤寒沙门菌的酶免疫传感器.用原子力显微镜表征其表观形态,循环伏安法监测其电化学特性.结果表明,在优化的检测条件下,免疫电极对目标菌的线性响应范围为103～109 cfu· mL-1,检出限为3.93×102 cfu·mL-1(S/N=3),4℃放置28 d后,响应电流为初始值的90.15％,具有良好的稳定性、特异性、重现性和准确性.多壁碳纳米管与离子液体结合制备的鸡白痢鸡伤寒沙门菌酶免疫传感器实现了检测信号的双重放大,检测灵敏度高,离子液体有助于保持酶标抗体的活性,延长免疫电极的有效时间.依据该方法构建的酶免疫传感器为快速检测其它致病菌酶免疫传感器的研究提供了良好的参照模型.     

猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR快速鉴定方法的建立

粪肠球菌和屎肠球菌是引起猪感染发病的优势肠球菌种,以肠球菌的16 S rRNA基因设计属特异性引物,利用SodA基因多态性设计种特异性引物,同时优化反应条件,建立了能同时测定猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR方法。通过对来源于猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株进行测定,均能成功扩增出属特异性片段和种特异性片段。经过与快速生化鉴定试剂盒(Vitek-32)和16 S rRNA测序方法比较,多重PCR与16 S rRNA测序方法对猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株的鉴定符合率100%;与Vitek-32鉴定符合率为62.3%,其中,与分离于感染猪的临床菌株符合率仅有46.7%,特别是感染猪的屎肠球菌,符合率仅为22.3%。