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111.
将禽白血病病毒J亚群(ALV-J)NX0101毒株接种1日龄和7日龄SPF雏鸡并设阴性对照组,采用实时荧光定量RT-PCR方法,定期检测病毒在体内的复制情况。根据GenBank发表的ALV-Jenv基因保守序列(AY897227)设计1对特异性引物扩增目的基因;根据鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列(K01458),在保守区内设计1对引物扩增内参照基因,分别克隆入质粒作为标准品制作标准曲线,采用SYBR GreenⅠ染料建立荧光定量PCR法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在线性关系;最低每个反应可检测到60个拷贝的病毒数,比常规PCR灵敏度高1 000倍。检测结果分别采用绝对定量法和相对定量法进行分析,都达到了良好的效果。通过对病毒含量变化的检测发现,在雏鸡4周龄时,2个接毒组ALV-J病毒突然呈对数式增长。据此分析ALV-J病毒在体内经过3~4周潜伏后,突然呈暴发式增长,这种情况可能和临床表现的免疫抑制直接相关。结果表明,本试验建立了一种特异性强、敏感性高、可定量分析ALV-J病毒增殖的方法,为进一步相关研究奠定了基础。 相似文献
112.
113.
H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立 总被引:2,自引:1,他引:2
通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,并制作标准曲线,建立了检测H3亚型猪流感的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为13.68,18.21和20.57;变异系数分别为0.31%、0.17%和0.12%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度. 相似文献
114.
根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4(Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21(DE3),诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析(Ni-NTA)纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB/c小鼠,抗血清ELISA效价达1:16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。 相似文献
115.
为了解血清2型猪链球菌(S.suis2)河南分离株的毒力基因型及cps2j全基因突变情况,本研究扩增S.suis2毒力基因gdh、cps2j、mrp、ef 、sly、orf2和fbps,并对s.suis2的cps2j进行全基因序列测定和同源性分析.结果表明,gdh、cps2j、mrp、ef、sly、orf2和fbps基因在8个S.suis2分离株中的检出率分别为100%(8/8)、100%(8/8)、62.5%(5/8)、75%(6/8)、87.5%(7/8)、100%(8/8)和100%(8/8);其中cps2j全基因核苷酸及推导的氨基酸序列与来源不同的S.suis2分离株同源性分别达98%和97%以上,以该基因构建的系统发育树表明8株S.suis2河南分离株与国内外不同参考株同源性高,亲缘关系密切. 相似文献
116.
本研究从上海市某鸭场发病鸭群中分离到1株DHV-1型强毒株,对其进行毒价测定、琼脂扩散试验和动物回归实验,结果显示:按103.41 ELD50/0.2 mL接种1日龄雏鸭,该毒株对雏鸭有明显的致病性,死亡率为60%,肝脏病变率为100%。经全基因组测序显示:该毒株长度为7652 nt,含626 nt的5'非编码区和314 nt的3'非编码区,编码一个2249 aa大小的多聚蛋白。根据Blast比对发现,该毒株属于经典的DHV-1A群,与韩国经典强毒株R85952(99.7%)和中国分离强毒株HP-1(99.3%)的同源性最高。 相似文献
117.
为建立一种快速、灵敏、简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)早期检测方法,本研究利用逆转录环介导恒温扩增技术(RT-LAMP),针对PRRSV的ORF5基因片段设计了4条引物,利用Bst DNA聚合酶在65 ℃恒温条件下进行逆转录扩增,通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和加入SYBR Green Ⅰ染料肉眼判断结果,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。结果表明,该检测方法具有良好的特异性,与其他常见病毒如猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒等无交叉反应,较普通RT-PCR灵敏性高100倍。采用RT-LAMP和RT-PCR分别对10份临床样本同时进行检测,符合率为100%。因此,本研究建立的RT-LAMP是一种可适用于临床PRRSV检测的快速、简单、灵敏、特异的检测方法。 相似文献
118.
119.
研究了天然草地、恢复草地和人工燕麦3种不同草地利用方式植被生物量与土壤氮矿化的变化。结果表明:3种土地利用方式,地上生物量大小依次为恢复草地〉燕麦〉天然草地,分别为424.02,381.72和307.26g/m^2,地下生物量主要集中在0-10cm土层,为天然草地〉恢复草地〉燕麦,总生物量地下地上比的大小也是天然草地〉恢复草地〉燕麦;植物种类及扰动大小是3种草地利用方式生物量差异的主要原因。随草地利用方式变化,植被构成、生物量发生变化,土壤氮素矿化作用也随之改变。3种草地利用方式,土壤净氮矿化速率大小为恢复草地〉天然草地〉燕麦。土壤氮矿化以硝化作用为主,硝态氮是形成生物量的有效氮素。天然草地的地下生物量最大,与其土壤净硝化速率最高有关,燕麦的土壤净氮矿化速率为负值,为植物生长提供的氮素较少,使其生物量最小。 相似文献
120.
将编码人雄激素受体(hAR)的雄素结合区(LBD)的cDNA片段(1005bp)克隆到由P1启动子控制的硫氧还蛋白表达载体pTrxFus上,构建了表达质粒pTrxAR,并转化到大肠杆菌G1724中,经色氨酸诱导表达后,SDS-PAGE分析,可观察到一高效表达的融合蛋白产物,此融合蛋白 分子了量与理论值相吻合,氨基酸组分分析证明了LBD目的基因的表达。 相似文献