苹果炭疽叶枯病病原Glomerella cingulata及其侵染过程

为明确苹果炭疽叶枯病病原菌围小丛壳Glomerella cingulata的侵染致病特征,在分离获得该病原菌的基础上,采用形态学观察、ITS序列分析和致病性测定对其进行了鉴定,并利用光学和扫描电子显微镜对病原菌在嘎啦苹果叶片上的侵染过程进行了研究.结果表明,在陕西咸阳地区分离获得的9株病原菌均为围小丛壳G.cingulata.25 ℃下接种9 h后,分生孢子中间产生隔膜,双胞化,并萌发产生芽管和附着胞;24 h后分生孢子的2个细胞均可萌发并形成芽管及附着胞,部分芽管顶端可产生次级分生孢子;48 h后次级分生孢子萌发形成附着胞;72 h后,附着胞下形成的侵染钉可直接入侵寄主,在表皮细胞内形成初生菌丝和次生菌丝,此时叶片表面已出现褐色斑点.接种7 d后叶片病斑处出现分生孢子盘和子囊壳.表明陕西省近年出现的苹果炭疽叶枯病病原菌为围小丛壳G.cingulata,该病菌在嘎啦叶片上的一些特殊侵染行为可能是导致该病害易在短时间内暴发的重要原因.     

条锈菌诱导下的小麦叶片总RNA提取方法的比较及LD-PCR扩增

为寻找一种既能提取到高质量高产量小麦RNA、又能提取到高质量条锈菌RNA的方法,利用Trizol法、Licl法、SDS法和Bizol法分别从条锈菌诱导的小麦叶片中提取了总RNA,并对Trizol法和Bizol法提取的RNA进行了长距离PCR(LD-PCR)扩增.结果表明,Trizol法、Licl法、SDS法和Bizol法提取的RNA产量(μg/100 mg鲜重叶片)分别为4.72、1.15、1.56、10.43 μg/100 mg,Trizol法和Bizol法提取的RNA产量明显高于Licl法和SDS法.Trizol法提取的RNA合成的cDNA片段大小主要集中在0.25～2.0 kb范围内,而Bizol法提取的RNA合成的cDNA片段大小主要集中在0.5～5.0 kb范围内,Bizol法提取的RNA反转录合成的cDNA质量好于Trizol法.Bizol法同样能提取到高质量的条锈菌RNA,而且提取RNA的成本较低.综合各种因素,Bizol法是条锈菌诱导下的小麦叶片总RNA提取的较理想方法.     

过敏素类蛋白研究进展

从过敏素类蛋白的结构、性质、诱导抗病反应的特点、及其在植物抗病反应信号传导和基因工程研究中的价值等方面进行了概述,提出了存在的问题,对其发展前景进行了展望．     

向日葵与锈菌互作过程中活性氧的积累

为了探讨向日葵品种与锈菌互作中活性氧的产生和积累与向日葵抗锈病性的关系,采用分光光度计法及联苯胺蓝(DAB)、氮兰四唑(NBT)染色法对过氧化氢(H2O2)及超氧阴离子自由基(O2-)诱导积累的过程进行了检测.结果表明:接种后抗、感病品种均出现H2O2和O2-双峰,侵染早期积累明显,最高峰出现在16 h,在抗病品种中活性氧产生和积累明显高于感病品种;在抗病品种中侵染位点活性氧的产生及积累较明显,接种后16h,侵染位点周围的染色范围较大,染色较深,H2O2及O2-的染色比例均达到最高,分别为65.5%和41%;而在感病品种的侵染位点没有检测到明显的活性氧积累.     

玉米矮花叶病毒特性及受侵叶片的超微结构

对玉米矮花叶病毒的病毒粒子形态、结构及其特性，感病叶片的超微结构进行了初步的研究。提纯病毒研究结果表明，MDMV粒子形态为线状，宽度为14nm，长度不等，完整粒子长度为720～750nm。病毒悬浮液经紫外扫描获得了典型的核蛋白紫外吸收光谱，最高吸收峰在257．5nm，最低峰在243．3nm，O．D280/O．D260约为0．73。在电镜下观察感病叶片的超微结构，可在细胞质内观察到大量的病毒粒子及风轮状、柱状内含体，体现了马铃薯Y病毒组的典型特征。同时，在感病组织内还可看到许多破坏的叶绿体、线粒体等。     

用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌EDR4突变体库

为筛选枯草芽孢杆菌EDR4拮抗相关基因,利用转座子TnYLB-1构建该菌株的插入突变体库。通过对种子液OD600值、转接培养液Ⅰ继续培养OD600值及转接培养液Ⅱ后的孵育时间3因素设计正交试验,转化过程中加入pMarA质粒的不同量及质粒与感受态细胞共培养的不同时间研究2因素对转化效率的影响,确定pMarA对EDR4的转化体系。通过50℃高温诱导培养产生EDR4的插入突变体,挑取单菌落2 756个,构建EDR4的插入突变体库,随机挑选14株突变体经PCR检测转座子TnYLB-1序列,发现转座子已成功插入到EDR4基因组中;进一步通过Southern杂交验证,发现转座子TnYLB-1主要以单拷贝形式随机插入,也有部分多拷贝插入。此突变体库的建立可为以后筛选该菌株拮抗相关基因等研究奠定基础。     

玉米矮花叶病毒株系、寄主范围及辅助成分的研究

对纯化的玉米矮花叶病毒进行株系鉴定，因人工接种约翰逊草不侵染，故定为MDMV-B株系；4科36种植物的接种试验表明。19种禾本科植物可作为其其寄主，以不同病毒汁液进行的蚜虫薄膜饲毒试验表明，存在不同于Con A的一种辅助成分。     

内生细菌EDR2的鉴定及其对油菜菌核病的防治

【目的】明确内生细菌EDR2菌株的分类地位以及对油菜菌核病的防治作用,为该菌株的进一步应用奠定基础。【方法】采用皿内和温室盆栽试验,测定菌株EDR2对油菜菌核病菌菌丝生长和菌核萌发的抑制作用以及对病害的防治效果;并结合菌体形态观察、生理生化特性测定以及16SrDNA序列分析确定该菌株的分类地位。【结果】内生细菌EDR2菌株能够有效抑制油菜菌核病菌的菌丝生长,并可导致菌丝出现畸形、细胞质外渗,同时其还对病菌的菌核萌发具有较强的抑制作用,培养原液的抑制率可达到96.6%。温室盆栽试验结果表明,菌株EDR2的培养原液和无菌培养滤液对苗期油菜菌核病均有良好的防治效果,其防效都在80%以上;菌株EDR2的喷施时间可影响其防治效果,其中以接种病菌前1d喷施防治效果最好,可达到95.4%;培养原液及不同倍数稀释液对病害的防治效果明显不同,随着稀释度的增加,其生防效果降低。菌株EDR2对供试的16种植物病原菌的菌丝生长均表现出一定的抑制作用,表现出较广的抑菌谱。结合形态和培养特征、生理生化特性及分子生物学鉴定结果认为,内生细菌EDR2属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。【结论】综合皿内及温室盆栽试验结果认为,内生枯草芽孢杆菌EDR2是1株对油菜菌核病具有较好防治潜力和开发前景的生防菌株。     

小麦黑胚病病原菌的分离及致病力差异的初步研究

对供试的6个小麦品种进行小麦黑胚病调查统计。结果显示,6个品种均有小麦黑胚病发生,前后两代籽粒黑胚率分别为 0.10%～21.10%和0.26%～25.22%,且不同品种间的发病程度存在差异。根据柯赫氏法则,分离所得主要病原菌为突脐蠕孢( Bipolaris sorokiniana )和细链格孢( Alternaria alternata ),分离率分别为6.67% 和76.67%;通过温室滴接试验,两种菌均能引起小麦黑胚病,突脐蠕孢和细链格孢的回接分离率分别为 99.50%和96.67%,前者的致病力比后者强;小麦黑胚病的两种主要病原菌从扬花期至乳熟期均可侵染,以扬花盛期和灌浆初期为侵染的最适时期。     

苹果树腐烂病菌GTP-环化水解酶II基因敲除载体构建及其突变体的表型分析

【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1（暂命名）,该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因（hph）进行片段融合。对得到的PCR产物及质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS进行双酶切,通过T4连接酶,将片段UP-HPH-DOWN连接到质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上,转化到JM109菌株中,挑取阳性克隆,提取质粒,得到含有hph的Vmgtp1敲除载体,再利用PEG介导的遗传转化获得抗潮霉素的突变体,然后用4对引物对突变体进行PCR检测及Southern Blot验证得到敲除突变体,最后对敲除突变体及野生型菌株03-8进行菌落颜色、菌落大小、繁殖体产生情况等表型分析和接种在离体苹果烫伤枝条上观察病斑大小的致病性检测,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】通过上述方法成功构建了表达GTP-环化水解酶II基因的Vmgtp1敲除载体,并利用PEG介导的遗传转化方法在苹果树腐烂病菌中进行了转化,共获得101个能够在含潮霉素PDA培养基上生长的突变菌株,经过PCR及Southern Blot对101个突变菌株进行分析验证,得到1个敲除突变体,编号为ΔVmgtp1-90。在PDA培养基上,敲除突变体ΔVmgtp1-90与野生型菌株03-8相比,ΔVmgtp1-90菌落平均生长速率为11.33 mm?d-1,03-8平均生长速率为24.67 mm?d-1,突变体菌落生长速率明显变慢,颜色变浅,气生菌丝稀疏;ΔVmgtp1-90光照培养40 d仍无繁殖体的产生,而03-8光照条件下培养15 d后就能产生繁殖体,30 d后有分生孢子从繁殖体上溢出。致病性检测试验发现,接种ΔVmgtp1-90菌株7 d后,富士苹果枝条上病斑的平均直径为9.3 mm,与之相比,接种03-8的苹果枝条病斑平均直径为24.8 mm,ΔVmgtp1-90致病性显著减弱。【结论】通过基因敲除和遗传转化获得苹果树腐烂病菌中表达GTP环化水解酶II Vmgtp1的敲除突变体ΔVmgtp1-90,比较Vmgtp1突变体与野生型菌株的表型及致病性差异,发现Vmgtp1可能参与调控苹果树腐烂病菌菌丝生长和繁殖体的产生过程,并且可能在苹果树腐烂病菌致病过程中起作用,但是是否起主要作用还有待进一步研究。