河北省棉花黄萎菌落叶型和非落叶型菌系初步鉴定

利用PCR特异性扩增技术对从采自河北省的228株棉花黄萎菌(Verticillium dahliae)、四川省的2株棉花黄萎菌(菌株Sch-1和Sch-3)、辽宁省的1株黄萎菌(菌株Ly-1)、棉花黄萎菌标准菌株(落叶型标准菌株T9和非落叶型标准菌株V97)和3株棉花枯萎菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)菌株进行了落叶型和非落叶型菌系的鉴定.结果表明,利用V.dahliae特异性引物DB19/DB22从233株黄萎菌中均可获得500 bp的特异性片段,而3株棉花枯萎菌中不能获得扩增产物.分别利用非落叶型特异性引物INTNDf/INTNDr和落叶型特异性引物INTD2f/INTD2r对233株黄萎菌进行PCR扩增.菌株Sch-1、Sch-3、Ly-1及非落叶型黄萎菌标准菌株V97利用非落叶型特异性引物INTNDf/INTNDr可扩增出1 100 bp的产物;采自河北省的228株黄萎菌和落叶型标准菌株T9利用落叶型特异性引物INTD2f/INTD2r可扩增出450 bp的产物.结果表明,目前河北省主要棉区棉花黄萎病菌以落叶型黄萎菌菌株为主.     

防治马铃薯黄萎病芽胞杆菌种子处理剂的研制及应用

芽胞杆菌属菌株已被广泛应用于植物土传病害的生物防治。本研究以枯草芽胞杆菌NCD-2和解淀粉芽胞杆菌Ba-2为有效成分开展了防治马铃薯黄萎病的种子处理剂研制。通过对载体、助剂种类及其比例的优化,明确种子处理剂的配方为：载体滑石粉75%、菌株NCD-2原粉13.33%、菌株Ba-2原粉6.67%、分散剂B 3.50%、润湿剂B 1.50%;制备的种子处理剂外观为浅黄色粉末,无团块。该菌剂粒径D50为36.78 μm,pH 6.85,贮藏后未出现结块和发粘现象,浓度介于1.5×10⁹～2.0×10⁹ CFU/g。作物安全性试验表明,种子处理剂用量在1～4 kg/667 m²拌种马铃薯种薯,校正出苗率与空白对照差异不显著;进一步研究以4 kg/667 m²拌种薯块不同时间对出苗的影响,明确拌种后不宜长时间放置,以2 d内播种为宜。两年多地田间试验表明,种子处理剂对马铃薯黄萎病的防治效果为48.58%～72.82%,增产为5.52%～14.32%。综合分析表明,该菌剂能够有效防治马铃薯黄萎病发生,且增产作用明显,具有广阔的应用前景。研究结果为该菌剂进一步的大面积推广示范应用奠定了基础。     

PhoR/PhoP双因子调控系统在枯草芽孢杆菌NCD-2菌株解磷能力中的功能分析

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NCD-2能有效的防治棉花黄萎病,同时还具有降解蛋黄卵磷脂的能力。将含有mini Tn10转座子的pHV1249质粒电击转入NCD-2菌株中,51℃高温诱导转座子插入突变,构建了NCD-2菌株的解磷突变子库,筛选到3株丧失解磷能力的突变子。运用染色体步移技术对突变株M216中转座子插入位点基因的侧翼序列进行克隆和序列分析,结果表明丧失解磷能力突变株中转座子插入基因与B.subtilis 168菌株中PhoR基因的相似率达到98%,Southern杂交验证突变株中转座子为单拷贝插入。将PhoR基因克隆到pHY300PLK质粒上构建重组质粒电击转化M216进行功能互补验证,互补菌株部分恢复了解磷能力,表明NCD 2菌株中PhoR基因与其降解卵磷脂能力具有相关性。     

河北省棉花立枯丝核菌菌丝融合群及其致病性研究

从河北省22个主要产棉县市分离纯化得到67个棉花立枯病菌菌株,经鉴定均为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)。菌丝融合试验表明,其中的62个菌株属于2个菌丝融合群,即AG-4和AG-2,分别占测定菌株的91.04%和1.50%;另有5个菌株与标准菌株不融合,占7.46%,表明河北省棉田立枯丝核菌的优势菌系是AG-4融合群。通过选用麦芽蛋白胨(MPDA)培养基(Ⅱ)进行对峙培养,将AG-4融合群菌株划分为6个不同的营养亲和群,即AG-4-A、AG-4-B、AG-4-C、AG-4-D、AG-4-E和AG-4-F,分别占测定菌株的59.02%,6.56%,9.84%,1.64%,21.31%,1.64%。致病力测定结果表明,不同菌丝融合群及其各营养亲和群致病力不同,以AG-4-A对棉苗的致病力最强,其次是AG-2,均导致棉苗死亡;AG-4-E和AG-4-F虽然致病,但并不致死棉苗,各群相对致病力强弱顺序依次为:AG-4-AAG-2AG-4-BAG-4-C非融合类AG-4-DAG-4-EAG-4-F。     

土壤含水量对美国黑莓光合特性的影响

为探索不同土壤含水量对黑莓光合特性的影响,以盆栽美国黑莓2～3年生扦插植株为试材,在6种土壤相对含水量(SRWC)条件下,对其光合特性进行研究。结果表明,土壤相对含水量为100%时,叶片净光合速率日变化呈单峰曲线;随着土壤含水量的降低,其净光合速率日变化呈双峰曲线。美国黑莓的光补偿点为50μmol/m2·s左右;SRWC为25%时,其光饱和点仅为330μmol/m2·s;SRWC为70%以上时,光饱和点均为1280μmol/m2·s左右。叶片的净光合速率及蒸腾速率随SRWC的升高而增加,气孔阻力随SRWC的升高而降低。水分利用率随着SRWC的降低而提高,呈极显著的负相关;新梢生长对土壤水分极为敏感。净光合速率与蒸腾速率呈显著正相关,与气孔阻力呈极显著负相关;蒸腾速率与气孔阻力呈显著负相关。美国黑莓的光合作用最适SRWC为85%;灌溉的临界SRWC为40%。     

生防枯草芽孢杆菌CAB-1抑菌蛋白产生条件及其稳定性研究

枯草芽孢杆菌CAB-1是一株对番茄灰霉病有显著防效的生防菌株,抑菌蛋白是其产生的主要抑菌物质之一。研究表明,菌株CAB-1产生抑菌蛋白的最佳培养条件为：接种量2%,培养温度30℃,转速180 r/min,装液量100 mL/250 mL,培养时间48 h。考马斯亮蓝法测得最佳培养条件下菌株CAB-1产生的粗蛋白浓度为0.16 mg/mL。该粗蛋白对胰蛋白酶及蛋白酶K不敏感,胃蛋白酶处理使其活性降低14%;抑菌蛋白在100℃以下处理30 min活性变化差异不显著,而121℃处理30 min其抑菌活性为对照的72%。抑菌蛋白对酸碱的耐受范围广,在pH值3~12的范围内抑菌活性均能保持在75%以上,pH值2时抑菌活性降低为对照的59%。经甲醇、氯仿、乙醚、乙酸乙酯及丙酮处理后该粗蛋白的抑菌活性变化不大。     

ywbB基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成和根际定殖能力的影响

为明确枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis NCD-2菌株生物膜形成相关基因及其在生物膜形成、根际定殖中的作用,采用转座子插入技术,从4000余株NCD-2突变子中获得6株生物膜形成能力降低的突变子。在生物膜形成能力丧失的突变子M3中,转座子以单拷贝的形式插入到ywbB基因内部。通过基因同源重组技术对ywbB基因进行缺失突变,获得ywbB基因缺失突变菌株NCD-2(ΔywbB),与野生菌株相比,突变子丧失了生物膜形成能力。进一步比较发现,突变菌株NCD-2(ΔywbB)显著降低了在棉花根际的群体数量,同时也降低了对棉花立枯病的防治效果。研究证明,ywbB是NCD-2菌株生物膜形成途径中的重要基因,且生物膜形成与NCD-2菌株根际定殖和生防效果呈正相关。     

防治番茄灰霉病的枯草芽胞杆菌BAB-1粉尘剂研制

目前我国农药登记的微生物杀菌剂主要为水剂和可湿性粉剂两种剂型。为了克服常规喷雾导致温室大棚内湿度增加给防病带来的不利影响,本文以枯草芽胞杆菌BAB-1为有效成分开展了粉尘剂研究,通过对载体和助剂的筛选,明确了最佳的载体、助剂种类及其比例,最终确定100亿CFU/g枯草芽胞杆菌BAB-1粉尘剂的配方为：滑石粉20%、分散剂GY-D900 2%、菌株BAB-1原药补足至100%。该制剂具有很好的悬浮效果（30 min时悬浮率>50%）。室内盆栽试验表明,菌株BAB-1粉尘剂对番茄灰霉病防效达到57.14%~71.43%,对黄瓜灰霉病的保护作用优于治疗作用,施用1次的防病效果分别为48.80%和1.65%;温室大棚试验结果表明,该制剂在番茄大棚中施用3次后对灰霉病的防效达到79.04%,对照化学药剂嘧菌酯800倍水溶液的防效为82.55%。该研究结果为枯草芽胞杆菌BAB-1粉尘剂的进一步产业化开发和应用提供了科学依据。     

脂肽类抗生素fengycin在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑制番茄灰霉病菌中的功能分析

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株及其无细胞发酵液对多种植物病原真菌具有较强的拮抗活性。为了明确NCD-2菌株抑菌作用机理,本研究利用快速蛋白液相色谱技术(FPLC)结合抑菌活性测定,对NCD-2菌株的脂肽类抑菌物质进行分离、纯化,经质谱鉴定,该抑菌物质为芬荠素(fengycin)。从NCD-2菌株中克隆出fengycin合成酶基因fenC及其上游启动子序列,通过同源重组技术对fenC基因进行了内缺失突变,同NCD-2野生型菌株相比,fenC基因缺失突变子丧失了fengycin的合成能力,同时该突变子显著降低了对番茄灰霉病菌的拮抗活性。进一步在离体叶片上比较了NCD-2野生型菌株和突变子之间脂肽提取物和菌体细胞对番茄灰霉病的保护作用,结果发现,突变子不论是脂肽提取物还是菌体细胞显著降低了对番茄灰霉病的防治作用。     

枯草芽胞杆菌NCD-2中调控因子PhoP对fengycin合成的调控作用

 PhoR/PhoP双因子调控系统是枯草芽胞杆菌中一个重要的全局性调控系统, 在低磷环境下, 感应激酶PhoR自磷酸化, 并且将获得的磷酸基团转移到调控因子PhoP上, 从而激活PhoP的调控活性。为了明确调控因子PhoP对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中主要抑菌活性物质-fengycin合成能力的调控作用, 本研究通过同源重组技术缺失突变NCD-2菌株中的phoP基因, 拮抗活性测定结果表明, phoP基因缺失菌株显著降低了对立枯丝核菌的抑菌活性。通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)技术比较了NCD-2菌株野生型及其phoP基因突变子fengycin的合成能力, 结果证明, phoP基因突变菌株降低了fengycin的合成能力。对突变子进行phoP基因互补发现, 互补phoP基因可使突变子的相关性状恢复到野生型菌株水平。以上结果证明, phoP基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中fengycin的合成具有正调控功能。