矮牵牛PDS基因的克隆及其在shRNA介导的基因沉默中的应用

以矮牵牛(Petunia hybrida)自交系‘Mitchell Diploid’(MD)为材料,通过3′RACE和5′RACE获得了其八氢番茄红素脱氢酶基因(PhPDS)的cDNA序列,进而通过PCR扩增出编码区的基因组序列。分析结果显示,PhPDS的cDNA序列全长2 182 bp,编码区序列1 746 bp,编码582个氨基酸。推测的蛋白质序列具有类胡萝卜素脱氢酶的保守结构域特征。编码区的基因组序列长7 609 bp,结构与番茄和拟南芥等PDS基因相似,具有14个外显子和13个内含子。利用博德研究所的小发夹RNA(shRNA)设计程序设计了两个针对PhPDS的shRNA,构建植物表达载体转化矮牵牛后,从其中一个载体的转化子中获得白色愈伤组织和幼枝,对白色幼枝的RT-PCR检测表明,其PDS基因的cDNA累积量减少,表明shRNA基因沉默技术能在矮牵牛中应用。以PDS基因为靶基因比用花色素合成基因研究基因沉默技术能更快地分析基因沉默的效果,全长序列的获得将有助于PDS基因在矮牵牛基因沉默技术研究中的应用。     

矮牵牛PMADS9基因的结构特征和mRNA的表达分析

 PMADS9基因是MADS-box基因AGL15亚家族成员,而AGL15基因被认为在开花植物中具有促进胚胎发生、延缓衰老进程的作用。使用PCR法克隆到了PMADS9基因的基因组序列EU338501,通过同家族基因比较分析发现矮牵牛PMADS9基因和番茄SIMBP11基因组织结构相似,和其他同源基因相比有着较长的第3外显子和庞大的1、2内含子等显著特征。通过Southern杂交初步判定其在基因组中可能为单拷贝。利用荧光定量分析发现PMADS9基因在花药和子房中优先表达,并在随后合子胚发育过程中持续表达,这与AtAGL15在拟南芥中的表达模式略有不同。对矮牵牛幼苗施加不同化学和物理处理后发现PMADS9基因对2,4-D和GA3处理有反应,并在多种胁迫环境下表达量增加,可能参与植物抗逆途径。     

Oleosin与GUS融合蛋白基因的植物表达载体的构建及融合蛋白性质的预测

将油菜油脂蛋白Oleosin基因与报告基因GUS通过6个氨基酸编码的凝血酶识别位点(Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Arg)连接起来,形成一个融合蛋白。其中编码区基因长2415bp,共编码804个氨基酸和一个终止密码子。使用蛋白质分析软件Antheprot.5.0和DNAstar对融合蛋白的理化特性,二级结构,潜在信号肽断裂位点,跨膜区进行分析表明:融合蛋白较好的保持了原来两个蛋白的理化特性和二级结构。将该融合基因克隆到中间载体pUC-121上,并用棉花LEA蛋白D-113基因启动子替换CaMV35S启动子,构建成植物表达载体pBI-LEA-O::G121。     

几种云南特有蔷薇资源的抗寒性研究

以维西蔷薇、大花香水月季、粉红香水月季、丽江蔷薇和中甸刺玫等几种云南特有的蔷薇野生资源为试验材料,研究了-5℃到-30℃低温胁迫下叶片相对电导率(REC)、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量及丙二醛(MDA)含量等抗寒性生理指标与抗寒性的关系,并利用Logstic方程拟合低温半致死温度(LT50)和枝条恢复生长试验对抗寒性进行评价.结果表明:相对电导率随胁迫温度的降低呈“S”型曲线变化,可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、丙二醛含量均随温度降低不断上升.枝条发芽率和成活率则随温度降低而减小.维西蔷薇的半致死温度最高,中甸刺玫的最低,分别为-15.71和-26.19℃.它们的抗寒性依次为:中甸刺玫＞丽江蔷薇＞粉红香水月季＞大花香水月季＞维西蔷薇.