高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱法筛选产溶血磷脂酸芽胞杆菌

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是一种重要细胞外信号递质和细胞内第二信使。本研究采用高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱(HPLC-QTOF-MS)技术对34株不同种类芽胞杆菌的代谢物进行测定。结果表明,供试的菌株中只有1株枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis FJAT-8784的代谢物中检测出产溶血磷脂酸,与Metlin代谢物质谱数据库中溶血磷脂酸的匹配得分达96.73,该化合物的质子化分子离子[M+H]+质荷比为439.281 9,质量数为438.275 8,推断出其分子式可能为C21H43O7P,其相对含量占发酵上清液总代谢物的1.32%。     

养猪发酵床不同发酵程度垫料微生物群落结构特征的PLFA分析

发酵床养猪是一种新型的养殖技术,可有效缓解养猪的环境污染问题,微生物在其中起关键作用。为明确养猪发酵床发酵过程微生物群落的变化规律,为发酵床的科学管理提供依据,本研究采用磷脂脂肪酸生物标记（phospholipid fatty acids,PLFA）法分析养猪发酵床不同发酵等级垫料的微生物群落结构特征。采用色差法将垫料分为3个发酵程度等级：1级、2级和3级,采集不同发酵等级表层（0~15 cm）和里层（30~45 cm）垫料样本,测定各样本的PLFA。结果表明,共检测到61种PLFA,发酵2级垫料的PLFA种类最多,发酵3级垫料的PLFA种类最少。在各垫料中,PLFA分布量均表现为细菌 > 真菌 > 放线菌。指示细菌、真菌、放线菌、革兰氏阳性细菌（G⁺）、革兰氏阴性细菌（G^-）的PLFA及总PLFA在各发酵等级表层垫料的分布量均显著大于其在里层垫料的分布量,最大值出现在发酵1级表层垫料中。与对照（未发酵垫料）相比,发酵垫料总PLFA含量均显著增加（P<0.05）。发酵3级表层垫料的真菌/细菌值最大,发酵2级表层垫料的G⁺/G^-值最大。多样性分析表明,Shannon指数和Pielou指数最大值出现在发酵2级垫料中,而Simpson指数最大值出现在发酵3级表层垫料中。聚类分析表明,当欧氏距离为233.15时,可将不同发酵等级垫料聚为3个类群,同一发酵级别的垫料聚在相同类群中;主成分分析表明,发酵1级表层和里层垫料单独归一类群,其他发酵等级垫料和对照垫料归另一类群中。综上,不同发酵等级垫料的微生物种群结构不同,发酵1级表层垫料微生物分布量最大,发酵2级垫料的微生物种类最多,相同发酵级别表层和里层垫料微生物群落结构相似。     

高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株的异质性

【目的】研究青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）Tn5转座子突变菌株的异质性,筛选出无致病力高效生防菌株。【方法】利用已构建的青枯雷尔氏菌致病力参考指标“弱化指数（attenuation index,AI）”和接种番茄植株的生物测定法对60株供试的青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株进行致病力测定;利用高效离子交换色谱法研究不同致病力突变菌株的色谱行为异质性;构建色谱效价指数（chromatography titer index, CTI_i）,CTI_i=S_i/（S₁+S₂+S₃）×100%（i=1、2或3;S₁、S₂和S₃分别对应P₁、P₂和P₃的峰面积）,测定不同致病力青枯雷尔氏菌突变菌株的CTI_i值,用皮尔逊相关系数（Pearson correlation coefficient,PCC）分析色谱效价指数与突变菌株的致病力和青枯病害防治效果的相互关系。【结果】基于AI值和生物测定结果,青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种不同致病力类型：强致病力、无致病力和中间型。强致病力菌株共33株,其AI值介于0.49-0.63,接种番茄15 d,植株发病率为66.33%-100%;无致病力菌株共有20株,其AI值介于0.78-0.89,接种番茄15 d,植株发病率为0;中间型菌株共有7株,其AI值介于0.68-0.73,接种番茄15 d,植株发病率为24.17%-45.92%。20株无致病力突变菌株对番茄青枯病的防治效果测定结果显示,防治效果介于16.68%-92.45%,菌株T831防治效果最好,达91.74%,其次是菌株T780,防治效果为87.51%,菌株T497防治效果最差,为16.68%。不同致病力青枯雷尔氏菌的高效离子交换色谱分离结果显示,青枯雷尔氏菌经高效离子交换色谱可以分离出P₁（出峰时间为0.6 min）、P₂（出峰时间为4.4或4.5 min）和P₃峰（出峰时间为5.9或6.0 min）;强致病力菌株和无致病力菌株均具有3种不同峰类型：单峰、双峰和3个峰,强致病力菌株的主峰为P₃峰,无致病力菌株的主峰为P₁峰,中间型菌株有双峰和3个色谱峰两种类型;强致病力菌株中CTI₃为100%的菌株,致病力最强,诱导番茄植株发病率均达85%以上,CTI₃＜100%的菌株,接种后番茄植株发病率介于66.33%-84.14%;无致病力菌株中CTI₁达100%的菌株,其防治效果高,均达到80%以上,CTI₁＜90%的菌株,其防治效果低,介于16.68%-63.62%;CTI₃与突变菌株致病力呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.62;CTI₁与无致病力突变菌株的防治效果呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.80。【结论】青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种致病力类型,不同致病力菌株的色谱行为不同。构建的色谱效价指数CTI₁可用于快速筛选出无致病力高效生防菌株,CTI₃可作为青枯雷尔氏菌致病力的参考指标。     

养猪发酵床垫料微生物及其猪细菌性病原群落动态的研究

微生物发酵床养猪是一种新型环保养殖技术。开展了微生物发酵床垫料微生物及其猪细菌性病原群落动态的研究,通过分离不同使用时间和层次基质垫层中的细菌、真菌和放线菌,分析微生物发酵床垫料微生物群落动态;分离基质垫料中大肠杆菌和沙门氏菌,研究其在发酵床垫料中的时间、空间分布动态,分析微生物发酵床对这两种病原细菌的抑制效果。结果表明,微生物发酵床中细菌分布数量最大,在各使用时间和层次的分布量均达到10⁷cfu·g^-1数量级以上,放线菌分布数量次之,真菌分布数量最小;细菌的分布数量呈现随着垫料使用时间的增加先上升后下降的趋势,而真菌和放线菌分布量随着垫料使用时间的增加而减少。基质垫料有一定量大肠杆菌和沙门氏菌的分布,分布数量与细菌呈显著的负相关,与真菌和放线菌呈显著正相关,在垫料使用的后期（使用5个月）比使用前期（使用1个月）分布数量明显减少,减少幅度分别为95.34%和44.41%,说明微生物发酵床对猪舍大肠杆菌和沙门氏菌病原能起到显著的抑制作用,控制由大肠杆菌和沙门氏菌病原引起的猪病害。     

保鲜功能微生物FJAT-0809-GLX对龙眼果实保鲜方法的优化

从施用浓度、贮藏方式和施用方法进行保鲜功能微生物短短芽孢杆菌FJAT-0809-GLX对龙眼果实保鲜方法的优化,找到一种合理有效而又低成本的方法对龙眼进行保鲜。结果表明,随着稀释浓度的升高,龙眼果实保鲜率逐渐下降,脱粒率逐渐升高,稀释10倍施用时,保鲜率最高,为75%。保鲜功能微生物喷施龙眼后,采用纸包裹龙眼进行贮藏,其保鲜率明显高于用树叶直接贮藏的效果,为53.28%。从喷施方法来看,保鲜功能微生物采前处理龙眼果实,其脱粒率为24.42%,明显高于采后处理的12.96%,保鲜功能微生物FJAT-0809-GLX采后处理的保鲜率最高,保鲜率为83.33%。     

青枯雷尔氏菌胞外蛋白指纹多态性分析

 采用SDS-PAGE技术对70株不同来源及致病力青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行胞外蛋白指纹多态性分析,研究结果表明,供试青枯雷尔氏菌菌株呈现丰富的胞外蛋白指纹多态性,多态性比率为100%。不同来源青枯雷尔氏菌分泌的胞外蛋白不同,EZ-Tn5TM插入诱变菌株电泳出20条不同大小蛋白条带,分子量集中在20~97 kD ,且菌株间蛋白条带相似或完全相同;60Co辐射诱变菌株共电泳出16条不同大小的蛋白条带,多数蛋白分子量44.3 kD;野生型菌株电泳的蛋白条带最多,共获得26条不同大小的蛋白条带。进一步对37株不同致病力的野生型菌株进行胞外蛋白含量测定,结果表明,不同致病力菌株胞外蛋白含量差异大,强致病力菌株分泌的胞外蛋白含量较高,为1.026～5.963μg/mL,无致病力菌株胞外蛋白含量较低,为0.083～0.761 μg/mL。     

瓜类作物枯萎病病原菌的分类鉴定及其ITS序列差异性分析

 【目的】鉴定福建省几种重要瓜类作物枯萎病菌,比较和分析它们的ITS序列差异和种内群体分化状况。【方法】通过分子鉴定结合形态鉴定,确定瓜类作物枯萎病菌的种类;通过它们的ITS序列亲缘关系和多重比较分析,分析该病原菌种内群体分化特点。【结果】供试的26个菌株属于两种镰孢菌：尖孢镰孢（Fusarium oxysporum）和串珠镰孢（Fusarium moniliforme）,其中F.oxysporum占54%,为优势种;这两种类型菌株的ITS序列差异较大,且主要表现在ITS2区间,差异达20.4%,而ITS1区间的序列完全相同或只有1个碱基的差异;F.oxysporum种内存在3类ITS序列,类型I与类型Ⅱ在376 bp处有1个碱基（C/T）的差异,类型Ⅱ比类型Ⅲ少1个碱基（A）;F.moniliforme种内也存在3类,类型Ⅰ与类型Ⅱ在320 bp处有1个碱基差异（T/C）,类型Ⅰ与类型Ⅲ有3个碱基的差异,分别是在38 bp处有1个碱基差异（A/C）,在395 bp处有1个碱基差异（T/C）,在429 bp处有1个碱基的差异（T/A）。【结论】福建省瓜类作物枯萎病菌为F.oxysporum和F.moniliforme。这两种镰孢菌种间的ITS序列差异较大且主要差异在ITS2区间,但是这两种类型镰孢菌种内ITS序列差异却很小。     

青枯菌无致病力菌株FJAT-1458与强致病力株FJAT-91的竞争生长作用

为了明确青枯菌无致病力菌株FJAT-1458的生防竞争机制,本研究采用体外共培养方法研究了碳源、氮源和培养时间对菌株FJAT-1458和青枯菌强致病力菌株FJAT-91竞争生长的影响;同时,研究了菌株FJAT-1458和FJAT-91在番茄植株体内的竞争生长。结果表明,碳源含量低于20%时,菌株FJAT-1458不能生长,而菌株FJAT-91可生长;无氮源条件下,FJAT-1458和FJAT-91均不能生长;碳源和氮源含量达100%时,FJAT-1458的菌体浓度（2.16×10⁹ cfu/mL）显著低于FJAT-91的菌体浓度（3.24×10⁹ cfu/mL）。混合培养24 h前,FJAT-1458生长量大于FJAT-91,24 h后则相反。在单独接种或混合接种5 d后,FJAT-1458和FJAT-91均在番茄植株体内出现最大定殖量,随后迅速减少;FJAT-91在单独接种15 d时,定殖数量为0;两种菌株单独接种的定殖数量均大于混合接种（接种15 d除外）。先接种FJAT-1458,3 d后接种FJAT-91对番茄青枯病的防效（100%）显著高于同时接种FJAT-1458和FJAT-91（74.67%）。本研究表明,在体外无致病力菌株FJAT-1458对碳源和氮源的营养竞争能力弱于强致病力菌株FJAT-91;在体内无致病力菌株FJAT-1458会抑制强致病力菌株FJAT-91的生长;因此,FJAT-1458的生防竞争机制中,营养竞争起非主导作用,而位点竞争可能是主导因素。     

不同海拔茶树根系土壤微生物群落多样性分析

从福建省泉州市安溪县不同海拔铁观音茶园采集了根系区域土壤, 利用磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记法研究了不同海拔茶园根系土壤微生物群落多样性。结果表明, 不同海拔茶树根系土壤共检测22个PLFAs, 不同的PLFAs在不同海拔茶树根系土壤分布差异明显, 可分为完全分布和不完全分布两种类型。高海拔(834 m)茶树根系土壤分布的PLFAs种类和数量都最多, 分布最高的前3个生物标记为16:0(指示细菌)、18:3ω6c(6,9,12)(指示真菌)、18:00(指示嗜热解氢杆菌)。对不同海拔茶树根系土壤特征微生物PLFAs分析表明, 代表细菌的16:0、代表真菌的18:3ω6c(6,9,12)和代表放线菌的10Me 16:0相对生物量在不同海拔茶树根系土壤中分布量不同, 细菌分布量最大, 其次是放线菌, 真菌分布量最小。微生物群落PLFAs标记聚类结果显示, 当欧氏距离为11.51时, 可将不同海拔茶园根系土壤的PLFAs生物标记分成3个大的类群, 类群I的PLFAs生物标记为完全分布且分布量中等, 类群Ⅱ的PLFAs生物标记为完全分布且分布量较高, 类群Ⅲ的PLFAs生物标记为不完全分布且分布量较低。分析多样性指数表明, Shannon-Wiener指数、Simpson指数和Pielou指数均是海拔834 m处最大, 海拔717 m处最低。     

甘蔗斑茅的杂交利用及其杂种后代鉴定系列研究(二):甘蔗斑茅远缘真实杂种的分子鉴定

根据斑茅ITS区序列设计编号为EF1／ER1和编号为EF2／ER2的两对引物,经在甘蔗及其近缘属植物间ITSPCR扩增,证明这两对引物是斑茅特异引物,其中引物EF1／ER1在斑茅多态性研究中扩增出5种带型,而引物EF2／ER2扩增出3种带型;同时,利用这两对引物对甘蔗(拔地拉)与斑茅杂交的9个F1,甘蔗斑茅真实杂种(崖城96-66、96-46)与CP84-1198的36个BC1以及崖城95-41与内江57-416的12个BC1,15个曾被认为具有斑茅血缘的品系进行分子鉴定,结果表明,两对引物的鉴定结果基本一致,其中对斑茅F1的分子鉴定结果与前人(沈万宽)的同工酶鉴定结果相一致,对15个曾被认为具有斑茅血缘的品系进行鉴定结果显示大部分品系为假杂种。