整合微生物组菌剂的提出、研发与应用

【目的】利用微生物发酵床作为发酵槽,猪粪氮素连续流加中温好氧发酵,将通过宏基因检测鉴定到的微生物组称为整合微生物组,生产高含菌量整合微生物组菌剂,作为植物病害生防菌剂。【方法】生产工艺:原料配制→发酵床发酵→猪粪氮素连续流加→好氧发酵控制→产品加工→产品包装等。生产技术:利用养猪使用1年以上的微生物发酵床,添加一层10 cm厚的30%豆饼粉+70%杏鲍菇菌糠垫料,每平方米1头猪作为猪粪氮素连续流加营养来源,每天翻耕1次,连续好氧发酵20 d后,取出上层20 cm的垫料,进入晾晒、粉碎、分筛、包装,加工成整合微生物组菌剂。【结果】整合微生物组菌剂产品技术指标:含水量29.74%,pH 7.56,有机质含量44.46%,全氮含量2.23%,腐殖酸含量11.20%,粗纤维含量14.06%,含菌量145×10 ⁸cfu/g。宏基因组测定结果表明,菌剂样品序列（reads）条数平均值为99 701.75,每克菌剂含有细菌39门、96纲、189目、383科、786属、1 281种;其中,芽孢杆菌46种,9种为中国新记录种,即:①嗜气芽孢杆菌（Bacillus aerophilus）、②蚯蚓芽孢杆菌（Bacillus eiseniae）、③丝状芽孢杆菌（Bacillus filamentosus）、④柯赫芽孢杆菌（Bacillus kochii）、⑤根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）、⑥长型赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus macroides）、⑦淤泥大洋芽孢杆菌（Oceanobacillus caeni）、⑧拾蛤鸟氨酸芽孢杆菌（Ornithinibacillus scapharcae）、⑨海洋枝芽孢杆菌（Virgibacillus oceani）;未发现猪细菌病原。可培养法分离的芽孢杆菌活菌数2.062×10 ⁸cfu/g,宏基因组测定结果中,芽孢杆菌的总丰度为1.42%,以此推算菌剂有效细菌总含量145×10 ⁸cfu/g。整合微生物组菌剂浸出液处理组的绿豆发芽率为96.67%,与清水对照组无显著差异（P>0.05）,但胚根长比对照增加了58.08%。用5%—10%的菌剂配制成育苗基质,番茄出苗率提高了3.0%,株高增加了25.1%,对番茄青枯病的校正防治效果可达79.41%。整合微生物组菌剂的产品质量标准参考农业农村部生物有机肥标准（NY884-2012）,初步确定为:有机质≥40%,含水量≤30%,pH 5.5—7.5,粪大肠菌群数≤100个/g,蛔虫卵死亡率>95%,有效期>6个月;重金属含量满足标准要求:砷<15 mg·kg ^-1,镉≤15 mg·kg ^-1,铅≤15 mg·kg ^-1,铬≤15 mg·kg ^-1,汞≤15 mg·kg ^-1;有效活菌数调整为:总细菌数≥30×10 ⁸cfu/g,其中芽孢杆菌≥2×10 ⁸cfu/g。 【结论】提出了整合微生物组菌剂的概念和产品技术标准。研发的整合微生物菌剂可促进种子根部生长,并对番茄青枯病有良好的防治效果。     

植物疫苗鄂鲁冷特对番茄青枯病的田间防治效果

为了明确植物疫苗鄂鲁冷特对番茄育苗及其田间青枯病防治效果的影响,在番茄育苗基质中添加植物疫苗,测定处理后种苗株高、根系长度及出苗率;在田间种植共设疫苗袋装、沟施、浇灌及生防菌剂、化学农药和清水对照6个处理,对根系土壤的养分含量、植株的生物学性状及青枯病发病率进行研究。结果表明,植物疫苗处理分别能使番茄植株株高、根系长度和出苗率提高13.71%、68.20%和56.66%;疫苗袋装和沟施处理的番茄根系土壤有机质、全氮、全磷、全钾和交换性钙含量均显著高于其它处理;疫苗袋装、沟施和浇灌均能显著提高番茄植株的株高、花数和产量,其中疫苗袋装处理效果最好,番茄产量最高为99.55 t/hm~2,对不同生育期的平均防治效果最高为93.47%。表明植物疫苗鄂鲁冷特的应用能育出壮苗,降低青枯发病率,提高产量。     

基于ITS序列和RAMS标记分析青枯雷尔氏菌的遗传多样性*

应用ITS序列和RAMS技术对福建省不同地域,不同寄主作物的青枯雷尔氏菌进行遗传多样性研究。结果表明,供试的21株青枯雷尔氏菌的ITS区序列有3种类型,这3种类型菌株的ITS序列只有1-2个碱基的差异,与参比菌株GMI1000的ITS区序列或者相同或者有1-2个碱基的差异。在此基础上,利用RAMS技术进一步分析表明,供试的青枯雷尔氏菌及参比菌株GMI1000的基因组DNA间存在丰富的多态性。聚类结果显示,供试菌株可聚为3个类群,同一寄主作物的菌株聚在同一类群中,同一地理来源的菌株聚在同一亚类群中,说明青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性,与寄主作物的关系更密切。     

无致病力青枯菌FJAT-a RS01的固态发酵及对茄果类蔬菜青枯病的防治效果

利用无致病力青枯菌研发植物疫苗防治青枯病是植物病害防治研究中的新途径。无致病力青枯菌FJAT-aRS01具有防效高和稳定遗传等特性。为了进一步开发利用该菌株,本研究以巨菌草渣为其主要发酵培养基,通过正交试验优化培养基配方和发酵条件,固态发酵FJAT-a RS01,并进行质量检测。结果表明,优化后菌株FJAT-aRS01固态发酵培养基配方为巨菌草渣36.36%、玉米粉27.27%、米糠27.27%和稻壳9.09%;发酵条件为接种量15%(10⁸ CFU/mL),料水质量比为1:0.8,装袋量为150 g/袋,发酵时间为48 h;在该发酵条件下,FJAT-aRS01的固态发酵物活菌数可达到1.80×10⁹ CFU/g,其营养成分含量超过微生物肥料的国家标准(NY/T 798-2015);FJAT-a RS01固态发酵物浸提液的50倍稀释液能促进番茄种子萌发,其100倍稀释液能促进辣椒和茄子种子萌发;在栽培基质中添加质量百分比≤15%的FJAT-aRS01固态发酵物能促进植株生长,添加质量百分比25%的FJAT-a RS01固态发酵物对于番茄、辣椒...     

福建青枯雷尔氏菌的遗传多样性及其生防放线菌的筛选

为了明确福建青枯雷尔氏菌（简称青枯菌）的遗传多样性,综合菌株的演化型、生化型及基于内源葡聚糖酶基因egl的序列变种鉴定,对福建省8个地区的番茄、辣椒和茄子寄主分离的56株青枯菌进行分析。结果表明：供试的56株青枯菌均属于演化型Ⅰ;53株为生化型Ⅲ（占94.64%）,1株为生化型Ⅱ,2株为非标准生化型;从序列变种来看,4株来自茄子的青枯菌均属序列变种15,24株来自辣椒的青枯菌中,23株属于序列变种14,1株为序列变种16,28株番茄青枯菌鉴定出7个序列变种。进一步,选择上述鉴定的生化型Ⅲ和生化型Ⅱ的代表菌株为靶标菌进行生防菌筛选。结果表明,供试14株放线菌中,筛选到1株对生化Ⅲ青枯菌有拮抗作用的放线菌FJAT-31535。基于菌落形态特征和16S rRNA基因序列相似性分析,菌株FJAT-31535属于链霉菌属（Streptomyces sp.）。     

不同致病力青枯雷尔氏菌诱导番茄防御相关信号途径基因的表达分析

[目的]探究不同致病力青枯雷尔氏菌诱导番茄防御相关基因的表达水平,为探明无致病力青枯雷尔氏菌的生防机制奠定基础.[方法]以无菌水为对照(CK),分别接种青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT91和无致病力菌株FJAT1458,接种后不同时间(0,3,6,12,24,36,48,72 h)取样,利用荧光定量PCR技术,检测接种...     

柑橘黄龙病植株内生菌PLFAs多态性研究

采用磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记法,分析柑橘黄龙病株不同部位及健康状态叶片内生菌群落结构。结果表明,从柑橘黄龙病植株叶片共检测到42种PLFAs,其中完全分布的生物标记有9种,不完全标记有33种。对PLFAs进行聚类分析表明,柑橘黄龙病株不同部位叶片内生菌PLFAs可以分为2大类群,类群I特点为脂肪酸生物标记均为不完全分布,类群Ⅱ的特点为脂肪酸生物标记在被检测的柑橘黄龙病植株的大部分叶片中均有分布。柑橘黄龙病株不同部位及健康状态叶片内生菌PLFAs组成及含量存在差异。总体来看,不同朝向中,东面叶片内生菌PLFAs含量最大;不同高度中,下部叶片内生菌PLFAs含量最大;不同健康状态中,带有黄龙病原叶片内生菌PLFAs含量比健康植株叶片更大。此外,不同朝向中,南面叶片真菌/细菌值最大,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的比值(G+/G)较大;不同高度叶片中,真菌/细菌值差异不明显,G+/G值差异明显,上部最大,下部次之,中部最小;不同健康状态中,健康叶片的真菌/细菌值高于黄龙病株叶片。对柑橘黄龙病株不同部位及健康状态叶片内生菌多样性研究表明,不同朝向和不同健康状态的叶片内生菌种群多样性指数差异显著,不同高度的叶片内生菌种群多样性指数差异不显著。主成分分析表明,主成分1和主成分2基本上能把柑橘黄龙病株不同朝向叶片内生菌种群区分开来。对柑橘黄龙病株不同部位及健康状态叶片进行聚类,结果表明带有黄龙病原的叶片聚为一类,不带黄龙病原的健康叶片分聚为两类,其中,不同朝向的叶片分聚在不同的亚类群中,表明柑橘黄龙病株内生菌PLFAs分布与叶片健康状态和叶片朝向均有紧密关系,与叶片健康状态关系更为密切。     

青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析

 利用青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)无致病力菌株防治番茄青枯病具有很好的应用潜力。作者通过分离筛选自然弱毒株、⁶⁰Co辐射诱变和EZ-Tn5插入诱变,分别获得3、12和40株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株。经盆栽番茄苗致病性检测,15 d后均未发病,证实均为无致病力青枯雷尔氏菌。进一步对番茄青枯病的防治试验表明,从番茄青枯病发病田块分离的无致病力突变菌株FJAT1458的防治效果最好,防效达100%。该菌株能定殖番茄植株根系土壤、根部和茎部,定殖数量均表现为“先增后减”的趋势,并且接种浓度越大、苗龄越小,定殖数量越大。从构建的防效模型可以看出,不同接种浓度条件下,植株发病率随时间变化符合的回归方程不同,相关系数R值也不同,接种浓度越大,R值越小。本研究获得的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT1458对番茄青枯病具有很好的防病效果。     

养猪发酵床垫料微生物及其猪细菌性病原群落动态的研究

微生物发酵床养猪是一种新型环保养殖技术。开展了微生物发酵床垫料微生物及其猪细菌性病原群落动态的研究,通过分离不同使用时间和层次基质垫层中的细菌、真菌和放线菌,分析微生物发酵床垫料微生物群落动态;分离基质垫料中大肠杆菌和沙门氏菌,研究其在发酵床垫料中的时间、空间分布动态,分析微生物发酵床对这两种病原细菌的抑制效果。结果表明,微生物发酵床中细菌分布数量最大,在各使用时间和层次的分布量均达到10~7 cfu·g~(-1)数量级以上,放线菌分布数量次之,真菌分布数量最小;细菌的分布数量呈现随着垫料使用时间的增加先上升后下降的趋势,而真菌和放线菌分布量随着垫料使用时间的增加而减少。基质垫料有一定量大肠杆菌和沙门氏菌的分布,分布数量与细菌呈显著的负相关,与真菌和放线菌呈显著正相关,在垫料使用的后期(使用5个月)比使用前期(使用1个月)分布数量明显减少,减少幅度分别为95.34%和44.41%,说明微生物发酵床对猪舍大肠杆菌和沙门氏菌病原能起到显著的抑制作用,控制由大肠杆菌和沙门氏菌病原引起的猪病害。     

荧光素酶标记无致病力青枯雷尔氏菌的生物学和定殖特性

为示踪青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum无致病力菌株FJAT1458在番茄植株及根际土壤中的定殖特性,采用电击法对菌株FJAT1458进行荧光素酶(luciferase,LUC)基因标记,并于室内采用生测法测定标记菌株的生物学特性、遗传稳定性、致病力及在番茄植株和根际土壤中的定殖能力。结果表明,成功将luc基因整合至无致病力菌株FJAT1458染色体上,标记菌株FJAT1458-LUC发出强烈的荧光,且PCR扩增出1 612 bp的luc基因片段;与野生型菌株FJAT1458相比,标记菌株FJAT1458-LUC的生长明显滞后,培养8h之后标记菌株FJAT1458-LUC的OD_600nm值均小于野生型菌株FJAT1458;且标记菌株FJAT1458-LUC连续传代20次后菌体浓度显著增加,发光菌体比例显著降低,LUC活性和luc基因表达量均随着传代数增加而显著降低;标记前、后菌株FJAT1458的弱化指数分别为0.90和0.89,且接种番茄植株30 d均未引起植株发病。标记菌株FJAT1458-LUC能在番茄根际土壤、根及茎中定殖,定殖数量呈...