莲雾黑腐病病原菌的鉴定及其生物学特性研究

通过病害症状观察、分离菌致病性测定,以及分离菌株的形态和培养性状观察、rDNA-ITS序列分析将从莲雾果实上分离到的菌株FJAT-9860鉴定为可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae.菌株FJAT-9860在PDA培养基上菌落最初为白色,后逐渐变为灰色到黑色.分生孢子为单细胞,无色透明,椭圆形至圆形.ITS序列分析表明,菌株FJAT-9860与Lasiodi plodia theobromae strain亲缘关系最近,同源性为99％.该菌株最适生长温度为25℃,最适生长pH值为8.0,不同碳源对菌株FJAT-9860的生长影响不同,最佳碳源为甘露醇.     

一株解淀粉芽胞杆菌的筛选及其益生特性研究

芽胞杆菌(Bacillus)已被广泛用作动物益生菌,其分泌的纤维素酶(cellulose)可以提高饲料利用率,改善动物肠道微生物菌群结构。本研究利用羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose,CMCNa)培养基从甘蔗(Saccharum officinarum)、麻类等纤维作物根际分离具有较高纤维素酶活性的芽胞杆菌,并对其纤维素酶的产酶条件、动物肠胃耐受性、对滤纸条纤维素的降解情况以及菌株的溶血性检验安全性进行鉴定。研究结果表明,获得了8株具有产纤维素酶活性的芽胞杆菌,其中菌株FJAT-29941的活性最高,形态学、生理生化和16S r RNA基因鉴定结果显示,该菌株为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);菌株FJAT-29941产纤维素酶的培养温度为20~50℃(最佳培养温度为30℃),pH为4.0~9.0(最佳pH值为9),培养时间18~72 h(最佳培养时间为42 h),最佳培养基为0.5%NaCl的营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基;利用1%胰蛋白酶的人工肠液和1%胃蛋白酶的人工胃液处理该菌株,其存活率分别为27.98%和64.91%,表明其具有较好的肠胃耐受性;菌株FJAT-29941在48 h内可以将滤纸条降解为小圆片,表现出较强的纤维素降解能力;该菌株在溶血性检测中未产生透明圈,是安全可应用的。本研究筛选获得的解淀粉芽胞杆菌FJAT-29941具有较好的纤维降解能力和动物肠胃耐受性,为益生菌研发提供了菌种资源和科学依据,具有良好的开发前景。     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX具有抑菌、抗褐变和保鲜功能。以短短芽胞杆菌菌株FJAT-0809-GLX总DNA为模板,采用PCR扩增超氧化物歧化酶(Supseroxide dismutase,SOD)基因,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行序列测定,结果显示SOD基因序列长度为609 bp(Gen Bank登录号:KM255665),编码202个氨基酸残基。将SOD基因片段与同样酶切的表达载体p ET-28a连接,构建重组表达载体p ET-28a-SOD,转入大肠杆菌BL-21,采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在菌体中存在约25 ku的蛋白表达产物,与该基因ORF预期大小接近。以上结果为进一步研究该酶的生理生化特性奠定了基础。     

pH胁迫下尖孢镰刀菌生长动力学模型

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是兼性寄生真菌,引起农作物枯萎病,防治困难。研究来自不同寄主的尖孢镰刀菌在不同pH马铃薯蔗糖(PS)琼脂培养基上的生长情况,构建动力学模型,以了解培养基的初始pH差异对尖孢镰刀菌生长特性的影响。测定了尖孢镰刀菌菌株在不同pH培养基、25℃培养条件下的生长速度,构建生长动力学模型。供试6个尖孢镰刀菌菌株在pH为3~10的液体培养基中均有不同程度生长,不同菌株对培养基pH的影响规律相似,在不同pH的PS液体培养基中培养14 d后,液体培养基的pH均有靠近6~7的趋势。在pH为3~9的培养条件下,尖孢镰刀菌菌落可以分成4类:菌丝型、粘滑层型、菌丝粘滑层型和菌丝带粉状物,各菌株的菌丝和培养基色泽也有所差异。同一菌株在培养基不同pH下生长速度不同,其生长的最适pH为6~8,菌落平均直径最大(45~49 mm),亚适pH为4、5和9;而在pH为3、10和11时菌落直径明显变小(17~21 mm)。培养14 d后培养基pH对菌落形态、色泽有一定的影响,不同菌株在不同pH培养基培养下产孢量也存在差异。pH在4~8时其平均产孢量最大,达(223.8~273.3)×104cfu.mL 1,其中pH为6.38(自然pH)时产孢量最高,pH为11时产孢量最低。供试菌株在不同pH条件下的菌落生长速度和产孢量变化动力学模型均符合二次曲线方程。     

整合微生物组菌剂的提出、研发与应用

【目的】利用微生物发酵床作为发酵槽,猪粪氮素连续流加中温好氧发酵,将通过宏基因检测鉴定到的微生物组称为整合微生物组,生产高含菌量整合微生物组菌剂,作为植物病害生防菌剂。【方法】生产工艺:原料配制→发酵床发酵→猪粪氮素连续流加→好氧发酵控制→产品加工→产品包装等。生产技术:利用养猪使用1年以上的微生物发酵床,添加一层10 cm厚的30%豆饼粉+70%杏鲍菇菌糠垫料,每平方米1头猪作为猪粪氮素连续流加营养来源,每天翻耕1次,连续好氧发酵20 d后,取出上层20 cm的垫料,进入晾晒、粉碎、分筛、包装,加工成整合微生物组菌剂。【结果】整合微生物组菌剂产品技术指标:含水量29.74%,pH 7.56,有机质含量44.46%,全氮含量2.23%,腐殖酸含量11.20%,粗纤维含量14.06%,含菌量145×10 ⁸cfu/g。宏基因组测定结果表明,菌剂样品序列（reads）条数平均值为99 701.75,每克菌剂含有细菌39门、96纲、189目、383科、786属、1 281种;其中,芽孢杆菌46种,9种为中国新记录种,即:①嗜气芽孢杆菌（Bacillus aerophilus）、②蚯蚓芽孢杆菌（Bacillus eiseniae）、③丝状芽孢杆菌（Bacillus filamentosus）、④柯赫芽孢杆菌（Bacillus kochii）、⑤根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）、⑥长型赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus macroides）、⑦淤泥大洋芽孢杆菌（Oceanobacillus caeni）、⑧拾蛤鸟氨酸芽孢杆菌（Ornithinibacillus scapharcae）、⑨海洋枝芽孢杆菌（Virgibacillus oceani）;未发现猪细菌病原。可培养法分离的芽孢杆菌活菌数2.062×10 ⁸cfu/g,宏基因组测定结果中,芽孢杆菌的总丰度为1.42%,以此推算菌剂有效细菌总含量145×10 ⁸cfu/g。整合微生物组菌剂浸出液处理组的绿豆发芽率为96.67%,与清水对照组无显著差异（P>0.05）,但胚根长比对照增加了58.08%。用5%—10%的菌剂配制成育苗基质,番茄出苗率提高了3.0%,株高增加了25.1%,对番茄青枯病的校正防治效果可达79.41%。整合微生物组菌剂的产品质量标准参考农业农村部生物有机肥标准（NY884-2012）,初步确定为:有机质≥40%,含水量≤30%,pH 5.5—7.5,粪大肠菌群数≤100个/g,蛔虫卵死亡率>95%,有效期>6个月;重金属含量满足标准要求:砷<15 mg·kg ^-1,镉≤15 mg·kg ^-1,铅≤15 mg·kg ^-1,铬≤15 mg·kg ^-1,汞≤15 mg·kg ^-1;有效活菌数调整为:总细菌数≥30×10 ⁸cfu/g,其中芽孢杆菌≥2×10 ⁸cfu/g。 【结论】提出了整合微生物组菌剂的概念和产品技术标准。研发的整合微生物菌剂可促进种子根部生长,并对番茄青枯病有良好的防治效果。     

龙眼微生物保鲜剂挥发性物质分析

利用筛选到的一株具有龙眼保鲜功能的微生物Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX生产的龙眼微生物保鲜剂“果立鲜”,不仅对龙眼等多种水果具有很好的保鲜作用,同时具有特殊的挥发性香气。为了解该菌株挥发性香气的成分,采用SPME/GC-MS的方法分析龙眼微生物保鲜剂“果立鲜”的挥发性物质成分24种,匹配度在90%以上的有11种。其中烷类8种,占总成分14.11%,包括正十六烷、十甲氧基五硅氧烷、十四烷、正十七烷、十八烷、2,6,10,14-四甲基-十五烷、4-甲基-十五烷、2-甲基-十五烷;烯类2种,占总成分的1.65%,包括(+)-长叶烯、(-)-α-柏木烯;酯类1种,占总成分的0.70%,为2-丙基-十四烷-亚硫酸酯。(+)-长叶烯、(-)-α-柏木烯这2种化合物是具有香气的成分,为天然的香料;2,4-二叔丁基苯酚是多种光稳定剂和抗氧化剂的重要中间体。     

尖孢镰刀菌β-D-葡萄糖苷酶的多态性

不同寄主尖孢镰刀菌β-D-葡萄糖苷酶活性具有明显差别,β-D-葡萄糖苷酶活性变化范围为8.7477-21.8007 U。各种瓜类作物尖孢镰刀菌的β-D-葡萄糖苷酶活性差异较大;非瓜类作物的尖孢镰刀菌的β-D-葡萄糖苷酶活性变化依次为斑兜>番茄>豌豆>辣椒。从瓜类作物上分离的尖孢镰刀菌的β-D-葡萄糖苷酶活性(平均值为13.8199 U)比非瓜类作物的高(平均值为9.6132 U)。     

微生物发酵床不同深度垫料的细菌群落多样性

为了解微生物发酵床不同深度垫料细菌的多样性,明确不同深度的细菌群落组成,采用五点采样法,收集了发酵床表层10 cm、中层30 cm、深层50 cm的垫料,分别进行垫料宏基因组DNA的提取,原核生物16S rDNA基因V3～V4区的扩增及Illumina高通量测序。试验共获得1 045 225条序列,共包含32门、303科、609属和1834类OTUs。表层垫料细菌数量最多,中层垫料细菌种类最多。微生物发酵床不同深度垫料的细菌群落有所差异,在表层垫料中,变形菌门(25.9%)和放线菌门(10.2%)相对含量高;中层垫料中拟杆菌门(27.8%)、变形菌门(25.1%)和厚壁菌门(17.0%)相对含量高。发酵床垫料表层和中层细菌多为有机物降解菌,主要为异常球菌——栖热菌门的特吕珀菌科、变形菌门的黄单胞菌科和拟杆菌门的黄杆菌科细菌。随着垫料深度增加,拟杆菌门(33.3%)和螺旋体门(9.2%)含量升高,厌氧菌如螺旋体门的螺旋体科、拟杆菌门的腐螺旋菌科在深层垫料中达到峰值。研究表明,表层垫料中微生物含量最高,代谢最为活跃,是主要的有机质降解层;深层垫料厌氧菌含量高。     

青枯雷尔氏植物疫苗菌60Co诱变菌株的生物学特性

利用60 Co辐射诱变青枯雷尔氏菌无致病力菌株FJAT-1458构建其突变体库,比较诱变后菌株与出发菌株在生长特性、防效、定殖方面的异质性。结果表明,60 Co诱变处理菌株的最佳剂量为200Gy,致死率达到92.5%。52株60 Co辐射诱变菌株中,有7株菌能提高对番茄青枯病的防治效果,为正突变,占13.5%;有11株菌的生防效果明显低于出发菌株的防治效果,负诱变率占21.6%,其中60 Co诱变后菌株FJAT-15022对番茄青枯病生防效果最好,在接种致病性青枯雷尔氏菌后第15d,对番茄青枯病防治效果达91.7%,明显高于出发菌株(83.3%)。60 Co诱变后菌株FJAT-15022的生长特性与出发菌株FJAT-1458不同,菌株FJAT-15022能在较高温度(40℃)正常生长,而出发菌株FJAT-1458在此温度下不能生长;二者的生长曲线不尽不同,主要表现在对数生长期,菌株FJAT-15022的生长速率大于出发菌株FJAT-1458,但差异未达显著水平。60 Co诱变后菌株FJAT-15022的定殖特性也与出发菌株FJAT-1458不同,菌株FJAT-15022的定殖时间比出发菌株FJAT-1458延迟5d,但出发菌株FJAT-1458的定殖数量高于诱变后菌株FJAT-15022。     

青枯雷尔氏菌胁迫对烟草植株抗氧化酶系活性的影响

以青枯雷尔氏菌RS-1403作为外源微生物,研究不同浓度青枯雷尔氏菌胁迫对烟草植株叶片PPO、POD、SOD酶活性的影响。结果表明:PPO和POD酶活性总和显著高于对照,而SOD酶活性总和除了处理2(接种浓度为2.35×10~4CFU/mL)外,其余的各个处理的均低于对照。烟草植株的根部、茎部和叶片的POD、PPO和SOD酶活性总和明显高于对照处理,并且其酶活性达到高峰的时间有所不同。胁迫接种5 d后,烟草植株叶片和茎部的POD酶活性和对照处理的比值最大,胁迫接种10 d后,烟草植株根部POD酶活性比值最大。烟草植株叶片和根部在接种15 d后,PPO酶活性和对照处理的比值达到最大,茎部PPO酶活性在接种5 d后比值最大。接种20 d后,处理烟草植株叶片和茎部的SOD酶活性和对照处理的比值达到最大,接种后25 d,根部SOD酶活性比值最大。