甘蓝自交不亲和信号传导中THL1和SRK相互作用的体外检测

在甘蓝自交不亲和信号传导中SRK和THL1之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用, 以甘蓝E1为材料, 采用RT-PCR技术扩增了THL1和SRK激酶结构域(记为SRK_E1)编码序列, 构建了THL1原核表达质粒pET43.1-THL1, SRK_E1原核表达质粒pET431-SRK_E1和真核表达质粒pPIC9K-SRK_E1, 分别在宿主菌大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达。THL1融合蛋白经胰岛素检测, 表明表达的THL1有氧化还原活性。建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法, 并用该方法对THL1与SRK_E1的相互作用进行了检测, 结果表明THL1可与SRK_E1相互作用并形成稳定的复合体, 这为深入分析THL1与SRK相互作用机理提供了理论和技术基础。     

结球甘蓝SSR检测体系的建立及优化

摘,要：以结球甘蓝自交系15R(南宝)和14S（北黑大平头）为试材,建立了甘蓝SSR-PCR反应体系,并从 PCR反应组成、扩增程序等环节对SSR-PCR反应体系进行了优化。即10.00 μL反应体系组成为：1× Buffer(含20.00 mmol·L^-1 MgCl₂)、50.00 μmol·L^-1 dNTPs、0.40 U Taq DNA聚合酶、0.40 μmol·L^-1 SSR引物、1.00 μL DNA(60.00 ng·μL^-1),加ddH2O至终体积10.00 μL;对基本扩增程序作了改进,适 宜的扩增程序为：94 ℃预变性5 min后进行20个迫降循环,94 ℃变性45 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸 1 min,每个循环降低0.5 ℃;再进行15个循环,94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min;72 ℃延伸10 min,16 ℃保存。对PCR产物的电泳检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染法）。     

甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究

采用PCR和RT2PCR技术, 以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆, 得到的片段长度分别为732 bp和455 bp。序列分析表明, 克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%, 两条序列内含子的大小不同; 同时, 前者第2内含子不符合典型的GT2AG规则: 即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a ( + ) , 构建融合表达质粒pET43.1a ( + ) -THL1, 在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白, 经胰岛素检测, THL1有氧化还原活性, 表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。     

甘蓝两种单倍型S-位点受体激酶胞外结构域(eSRK)和S-位点半胱氨酸富集蛋白(SCR)基因的克隆及其相互作用特异性检测

S-位点受体激酶(SRK)和S-位点半胱氨酸富集蛋白(SCR)是自交不亲和反应中雌、雄性决定因子,两者是受体与配体关系,相互作用具有单倍型特异性。为建立适于SRK与SCR单倍型特异性识别及作用机理研究的技术体系,本研究以甘蓝(Brassica oleracea L.)高代自交系E、F为材料,首先,采用亲和指数法测定两种材料的亲和性,结果表明,E、F为强自交不亲和系,两者间异交亲和;其次,从E、F材料gDNA中扩增eSRKE、eSRKF、SCRE和SCRF基因编码序列,同源比对表明,E为S28单倍型、F为S7单倍型;再次,利用酵母双杂交Gold系统检测eSRKE、eSRKF和SCRE、SCRF间的相互作用,结果显示,eSRKE与SCRE、eSRKF与SCRF之间作用,eSRKE与SCRF、eSRKF与SCRE之间不能作用,这与利用亲和指数法检测的结果完全一致。研究结果建立了为进一步探索SCR与SRK的识别与作用机理的技术体系。     

六种甘蓝自交不亲和雄性决定因子部分cDNA的克隆及序列分析

S-富含半胱氨酸蛋白(SCR)是自交不亲和雄性决定因子,为了比较甘蓝不同S单倍型SCR基因结构和蛋白分子特性,依据mRNA的ployA序列和SCR保守氨基酸序列设计引物,利用巢式PCR技术分别获得了6种甘蓝(Brassica oleracea L.)D3、E1、240、A1、N1和G1的SCR基因的部分cDNA序列,均包含3’UTR。生物信息学分析表明,6条cDNA序列长度分别为319、311、290、288、385和377bp,分别编码1个58、58、58、58、58和55个氨基酸的SCR蛋白,其中D3的SCR与SCR3序列一致,甘蓝E1、240、A1和N1的SCR与SCR7序列一致,而甘蓝G1的SCR为一个新的S单倍型基因。研究表明,不同S单倍型的SCR二级结构和三维结构都有差异,其与S-位点受体激酶(SRK)相互作用的氨基酸在SCR分子表面,富含碱性氨基酸,且SRK-SCR相互作用需要静电荷参与。同时研究还表明,甘蓝自交不亲和性强度多样性,除了SCR和SRK本身作用能力因素以外,还与SCR和SRK分子的数量有关,而SCR的数量是通过3’UTR在mRNA水平调控的。分析表明,SCR的进化速度很快,并且3’UTR的进化速度高于氨基酸编码区的进化速度。本研究为进一步探索和利用自交不亲和机制提供了理论基础。     

DNA分子标记及其在番茄遗传育种中的应用

介绍了RFLP,RAPD,SPAR,SSR—锚定PCR,AFLP,STS,CAP和SNP等DNA分子标记的概况,以及它们应用于番茄基因组作图及遗传育种研究的最新进展,包括：遗传多样性研究、品种指纹图谱及杂种纯度鉴定、基因定位、标记辅助选择、比较基因组研究、基因克隆等,并就今后番茄分子育种主要研究方向进行了讨论。     

甘蓝自交不亲和细胞信号转导的功能基因研究进展

自交不亲和性是开花植物防止近亲繁殖而广泛存在的一种遗传屏障,在育种工作中意义重大,它在遗传上受一个带有复等位基因的多态性S基因座所控制。本文综述了近年来在甘蓝自交不亲和信号转导途径中相关功能基因的研究进展。SRK基因和SP11/SCR基因是控制甘蓝自交不亲和性的两个关键因子。SRK基因是雌蕊柱头中自交不亲和反应的专一决定因子,编码SP11/SCR基因的蛋白在花药壁和花粉中特异表达。编码SLG基因的蛋白在自交不亲和反应中起增强SRK活性的作用。另外也对信号传导途径中下游蛋白质的作用模式作了展望。     

甘蓝LFY基因的克隆及序列分析

以甘蓝ZQ启动抽薹的茎尖为材料,分别提取DNA和RNA,以两对引物扩增并序列拼接得到甘蓝LFYZQ基因DNA序列和cDNA完整编码区,长度分别为2 560、1 239 bp,与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜同源性分别达到91 %、87 %、86 %、87 %。该基因含有3个外显子（452、394、393 bp）和2个内含子（514、807 bp）,共编码412个氨基酸,内含子剪接位点均符合经典GT-AG法则。将LFYZQ与网上公布的12种十字花科植物LFY氨基酸序列按分子进化分成两类：甘蓝LFYZQ与花椰菜以及Jonopsidium属植物Jonopsidium acaule这3个分为一类;其余10种植物分为第二大类。LFYZQ蛋白分子量为46 kD,是一个不稳定的疏水蛋白,存在N-十四（烷）酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰胺化位点共4种活性位点。     

春甘蓝新品种西园11号的选育

西园11号是以优良自交不亲和系2004G为母本,以自交不亲和系2004I为父本配制的春甘蓝一代杂种。该品种全生育期165～185 d（天）,叶球高扁圆形,叶球紧实,叶质脆嫩,商品性好,单球质量1.5 kg左右,球叶VC含量344 mg?kg-1（FW）,纤维素5.8 g?kg-1（FW）,可溶性固形物5.1 %,耐先期抽薹,一般产量为3 500 kg?（667 m2）-1左右。适宜重庆、四川等地区作春甘蓝栽培。     

芸薹属自交不亲和功能因子及分子机制研究进展

芸薹属的自交不亲和性受S位点基因控制,其上的SRK基因和SCR/SP11基因是自交不亲和反应中的两个关键因子,另外所发现的其他因子也对自交不亲和发挥了重要作用。文章介绍了影响自交不亲和的功能因子及其分子结构特征和功能,对自交不亲和反应的分子机制作了进一步阐述,同时对这些功能基因在芸薹属植物甘蓝染色体组上的定位研究作出展望。