芸薹属A基因组DNA封阻下的C染色体组核型分析

为了探索一种高效可靠的芸薹属植物核型分析方法,本文以甘蓝和白菜为实验材料,分别提取甘蓝基因组DNA用地高辛标记为探针,提取白菜基因组DNA作为封阻剂,对甘蓝有丝分裂中期染色体进行原位杂交,每对同源染色体上显示出了特定的原位杂交信号,将甘蓝的9对染色体进行了精细的分型。为区分像甘蓝这样的小型染色体提高了一条可行且精确的方法,并为研究甘蓝自交不亲和性信号传导相关基因在染色体上的定位奠定重要基础。     

结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因BoCML49的克隆及表达分析

以结球甘蓝E1为材料,提取花粉萌发前和萌发后的混合花粉总蛋白,总蛋白双向电泳后通过MALDI-TOF-MS鉴定分析差异点,根据差异点分析结果,利用同源克隆得到甘蓝BoCML49基因707 bp的cDNA片段。通过对BoCML49基因的qPCR分析表明其表达量在花粉萌发前约为萌发后的2.73倍,表明BoCML49基因在花粉萌发后表达下调。通过5¢-Race和3¢-Race分别得到550 bp和721 bp大小cDNA片段,最终得到结球甘蓝BoCML49全长cDNA序列,开放阅读框位于125~
1 078 bp处,加尾信号(AATAAA)位于第1 222 bp处。通过cDNA推导得到的氨基酸序列分析表明,BoCML49编码317个氨基酸残基,预测分子量为33.51 kD,pI为6.93,经Smart-embl预测其含2个重要的EF-hand结构,分别位于序列第150~178和第216~244位氨基酸残基处,预测结果显示其含有7个α-螺旋和10个β-折叠结构。系统发育树表明结球甘蓝BoCML49与拟南芥AtCML49和AtCML50的亲缘关系较近。BoCML49基因的原核表达得到37.55 kD的融合蛋白。     

甘蓝SCR识别与结合SRK胞外域核心编码区DNA序列的酵母双杂交检测

SCR是芸薹属自交不亲和性的雄性决定因子。为研究SCR与SRK之间相互作用的核心区段,通过构建结球甘蓝的包含系列不同长度的SCR的cDNA序列的pGBKT7融合载体,利用酵母双杂交系统检测SCR与SRK之间的相互作用。结果显示,构建的载体均未出现自激活现象,所获得SCR全长与其相对应SRK胞外域具有相互作用,且相互作用核心编码区位于SCR编码基因的第97~186 bp处。实验结果还显示,此单倍型的SCR信号肽剪切位点及相邻的几个氨基酸残基对相互作用实验结果有干扰作用。以上结论为包括甘蓝在内的芸薹属自交不亲和机制的研究提供了新的实验依据。     

褪黑素诱导采后冬枣抗黑斑病的研究

分别用0、2、20、200μmol/L褪黑素处理接种链格孢菌(Altrenaria alternata)的采后冬枣,研究褪黑素对冬枣采后黑斑病的抗病作用.结果显示:褪黑素处理可以抑制病斑直径的扩展,降低冬枣的腐烂指数和失重率,抑制冬枣呼吸速率和相对电导率的上升,使丙二醛(MDA)含量保持在较低水平;此外,褪黑素处理还提高了苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶(CHI)、β-1,3-葡聚糖酶(GLU)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性以及抗病相关物质(黄酮、总酚、木质素)的含量.上述结果表明,褪黑素可以通过激活抗病相关酶活性和提高抗真菌物质含量来提升冬枣采后抗黑斑病的能力,可作为一种有潜力的激发子,提高果实对采后病原菌的抗性,从而用于采后果实的腐烂防治.     

大蒜不定芽的诱导及其增殖系数的调节

为获得白皮大蒜组培繁殖体系，以其茎尖为材料，通过BA和NAA不同激素配比试验研究，结果表明：诱导愈伤组织的最适培养基为：MS+BA 0.2mg/L + NAA 0.5mg/L，诱导率达60%；诱导不定芽的最适培养基为：MS +BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg/L，丛生芽繁殖系数高达80%。同时，为建立扩繁最佳体系，分别研究了激素、pH、谷氨酸钠三因素对不定芽增殖系数的调节效果，研究表明：添加0.5mg/L的GA3使增值系数提高到13.8；pH5.8最利于不定芽增值；添加10mg/L谷氨酸钠能在多次继代培养中保持较高的增值系数。     

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR以及其他分子生物学方法，以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对MLPK基因进行扩增克隆，首次得到长度分别为1 615 bp和1 294 bp的基因片段。序列分析表明，甘蓝MLPK与芜菁MLPK的cDNA序列相似性达98%，前者的内含子数为4个，比后者少了3个；同时，在前者内含子中发现了不同于典型的GU-AG规则的新的序列，即第3、4个内含子5′端碱基是TA、CG，3′端碱基为CAGG、GT，推测甘蓝MLPK的mRNA具有独特的剪切机制。这为甘蓝自交不亲和分子机理研究提供了新内容。     

甘蓝自交不亲和信号传导中THL1和SRK相互作用的体外检测

在甘蓝自交不亲和信号传导中SRK和THL1之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用, 以甘蓝E1为材料, 采用RT-PCR技术扩增了THL1和SRK激酶结构域(记为SRK_E1)编码序列, 构建了THL1原核表达质粒pET43.1-THL1, SRK_E1原核表达质粒pET431-SRK_E1和真核表达质粒pPIC9K-SRK_E1, 分别在宿主菌大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达。THL1融合蛋白经胰岛素检测, 表明表达的THL1有氧化还原活性。建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法, 并用该方法对THL1与SRK_E1的相互作用进行了检测, 结果表明THL1可与SRK_E1相互作用并形成稳定的复合体, 这为深入分析THL1与SRK相互作用机理提供了理论和技术基础。     

甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究

采用PCR和RT2PCR技术, 以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆, 得到的片段长度分别为732 bp和455 bp。序列分析表明, 克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%, 两条序列内含子的大小不同; 同时, 前者第2内含子不符合典型的GT2AG规则: 即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a ( + ) , 构建融合表达质粒pET43.1a ( + ) -THL1, 在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白, 经胰岛素检测, THL1有氧化还原活性, 表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。     

甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究

 为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16 ~ 421 bp的片段和SCR第1 876 ~ 2 068 bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。     

甘蓝MLPK的原核表达及其互作蛋白分离体系的建立

M–位点受体激酶（MLPK）是甘蓝自交不亲和反应的正向调控关键元件,其参与自交不亲和反应的分子机制尚不明确。为了分离与MLPK相互作用的蛋白,在分析了MLPK功能域的基础上采用PCR技术扩增了MLPK激酶结构域编码序列（记为MLPKK）,通过体外定点突变技术构建了两种MLPK失活突变体（记为mlpk1和mlpk2）,然后以pET43.1a为载体构建了原核表达质粒pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1和pET43.1a-mlpk2,并进行了原核表达和纯化。纯化的融合蛋白pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1和pET43.1a-mlpk2分别与高度自交不亲和甘蓝‘A4’柱头总蛋白提取液进行孵育,孵育后利用融合蛋白序列中的6× His标签与Ni+结合的特性,钓取MLPK的互作蛋白,建立了分离MLPK互作蛋白的新方法。孵育产物经SDS-PAGE电泳显示,与两个突变体蛋白泳道对比,在pET43.1a-MLPKK与柱头总蛋白提取液孵育产物的泳道中成功获得了候选的与MLPK互作的蛋白条带,这为后续互作蛋白质谱鉴定以及功能解析提供了技术支持。