Ⅰ亚群禽腺病毒通用PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、特异、敏感的Ⅰ亚群禽腺病毒(FADV-Ⅰ)临床通用PCR检测方法,本研究根据Gen Bank登录的FADV-Ⅰ不同血清型基因组序列,比对分析后选择病毒DNA聚合酶基因设计通用检测引物,优化PCR体系各反应条件,确定该方法的敏感性与特异性,建立了检测FADV-Ⅰ通用PCR方法,并将其进行了临床应用与感染SPF鸡脏器组织病毒分布检测比较。结果显示,经优化确定引物浓度为1.0μM,退火温度为50.4℃～61.0℃,该方法能够特异性扩增该亚群病毒494 bp的DNA聚合酶基因,对产蛋下降综合征病毒、马立克病毒、鸡痘病毒等扩增结果均为阴性,特异性强;该方法的检测限为2.8×102拷贝/μL病毒PCR产物标准品;对临床病例经PCR检测、病毒血清型鉴定与分离结果显示,该方法与病毒分离方法符合率达100%,且检测的病毒被鉴定为4、8a、8b和11血清型FADV;对病毒感染鸡脏器组织检测结果显示,该方法对其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃与肌肉样品均可以检测到该病毒,较文献报道方法更敏感。以上结果表明本研究建立的PCR检测方法具有通用、特异、敏感、快速、准确等特点,能够用于FADV-Ⅰ的临床检测,为防控该亚群FADV引发的疫病提供了技术保障。     

肉犬波氏杆菌病的诊断与防治

波氏杆菌为革兰氏阴性细小球杆菌,能引起多种动物支气管肺炎等呼吸系统疾病,特别对幼龄动物危害更加严重。本文报道的是某养犬户饲养的肉仔犬感染了以呼吸困难和急性死亡为主要临床症状的病变,根据临床症状、剖检变化和实验室检查,诊断为败血性支气管波氏杆菌病。1发病情况滨州市郊区某养殖场,兔、犬同场。l个月前,饲养至2～3月龄的免,突然发生了以呼吸困难并急性死亡为特征的疾病,发病率为20％,病死率达70％以上。l个月后同场饲养的3月龄犬也发生了以呼吸困难并急性死亡为特征的疾病,发病率为15％,病死率达60％以上。经用青、链…     

无乳链球菌LIP蛋白的截短表达及免疫保护性研究

为评价罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)BX2012株脂蛋白(lipoprotein)的免疫原性及其对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)的保护效果,以无乳链球菌脂蛋白基因序列(GenBank序列号:CP000114.1,SAK_0321)的B细胞线性抗原表位区设计特异性引物进行扩增,构建重组表达载体,将截短表达的脂蛋白制备成亚单位疫苗,同时制备灭活疫苗进行免疫比对。结果显示:重组表达载体p ET-32a-LIP342在BL21(DE3)中获得了良好的可溶性表达,分子质量约为30 kDa,纯化使LIP342纯度由41.75%提至87.23%;Western blotting分析显示,LIP342可被兔抗无乳链球菌高免血清特异性识别;LIP342在目前已知不同种属来源或不同血清型的无乳链球菌分离株中同源性为90.35%~100%,在罗非鱼源分离株中同源性为100%;无乳链球菌LIP342蛋白和灭活疫苗均可显著提升奥利亚罗非鱼和大菱鲆血清抗体水平,而LIP342诱导的血清抗体水平均显著高于灭活疫苗;经0.1 mL 1×10~9cfu/mL的无乳链球菌攻毒后,LIP342蛋白和灭活疫苗对供试鱼的累积存活率均显著高于PBS对照组。结果表明,高度保守的LIP342具有较好的免疫原性,可作为无乳链球菌亚单位疫苗候选因子。     

产气荚膜梭菌B型C58-1株β1毒素基因的克隆表达

利用PCR技术,从B型产气荚膜梭菌中国标准株C58-1株扩增出β1毒素基因,连接pMD18-T 载体筛选阳性克隆,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收927 bp的β1毒素基因片段,将其定向克隆到载体pET-32a中,获得重组质粒pETβ927。将pETβ927转化至受体菌BL21(DE3)中,其表达产物经His-Trap FF预装柱纯化、SDS-PAGE 检测目的蛋白大小和分布及Western blotting检测其反应原性。结果表明,完整的β1毒素基因大小为1 011 bp,与GenBank发表的B型和C型产气荚膜梭菌β1毒素蛋白序列同源性达99.4%以上;SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白大小为 54 ku,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但以包涵体为主。Western blotting检测结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体发生免疫反应,表明β1毒素蛋白具有较好的反应原性。     

猪流行性腹泻病毒研究进展

猪流行性腹泻病毒是引起猪腹泻的重要病原体之一,广泛流行于世界各地,造成了重大的经济损失。文章阐述了猪流行性腹泻病毒的分子生物学特点,概括了病毒的检测方法,并对近年来流行病学及疫苗的研发情况进行了综述,以期对猪流行性腹泻病毒研究提供帮助。     

猪链球菌rGDH蛋白原核表达载体的构建及免疫原性分析

谷氨酸脱氢酶(GDH)在猪链球菌35个血清型中都存在,是一种具有免疫原性的保护性抗原。本试验PCR扩增出GDH基因,酶切定向插入pET-32a中构建表达载体pET-32a-GDH,将其转化E.coli BL21(DE3)表达菌中,培养并诱导表达rGDH蛋白,产物纯化后免疫新西兰白兔,免疫攻毒保护试验检验该蛋白的免疫原性。PCR试验获得约1 300 bp的GDH基因,双酶切pET-32a-GDH表达载体获得5.4和1.3 kb的片段,IPTG诱导表达获得融合蛋白,免疫保护结果达到70%。结果表明,本试验成功构建表达猪链球菌GDH蛋白的原核表达载体pET-32a-GDH,rGDH蛋白以蜂胶为佐剂免疫模型动物后,免疫保护率达到70%,为猪链球菌亚单位疫苗的研制提供了技术支持。     

水貂犬瘟热病毒LD-1株的分离与鉴定

取山东某貂场疑似犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）感染的水貂肝脏等组织病料,通过RT-PCR检测呈CDV阳性,且无水貂细小病毒存在,将病料接种原代CEF细胞、传代系Vero细胞和DF1细胞3种细胞进行病毒分离,通过优化细胞培养条件,最终在Vero细胞上传代培养成功,出现露珠状典型细胞病变（CPE）。分离毒应用RT-PCR、PCR产物测序、抗体中和试验（SN）、间接免疫荧光试验（IFA）及病毒包涵体检查等多种方法进行了CDV的鉴定,结果显示CDV阳性,表明分离到的病毒为水貂CDV,并将其命名为CDV LD-1株。     

尼帕病毒流行病学研究进展

尼帕病是由副黏病毒科中的尼帕病毒引起的新型烈性人畜共患传染病,其严重威胁人类与猪等动物的健康。作者就尼帕病毒的病原学特征、流行病学和临床症状等进行了概述,以期初步了解尼帕病毒。     

伪狂犬病毒Sa株gI-/gE-/YFP+基因缺失载体构建及突变株筛选

根据伪狂犬病病毒SA株的gI和gE基因序列,设计两对引物,缺失掉gE基因5’端738bp,在克隆测序的基础上,采用酶切方法构建了含部分gE基因的转移载体pBgIE,同时将pBLYFP载体上含CMV启动子、多克隆位点、黄色荧光蛋白(YFP)基因和polyA尾巴的表达盒双酶切后插入到缺失位置,构建转移载体,命名为pBgIE-YFP,为下一步开发以伪狂犬病病毒为载体的基因工程疫苗提供了基础。     

两株不同地区副猪嗜血杆菌的分离及分子生物学鉴定

本试验从浙江和河南部分地区的送检的疑似患多发浆膜炎与关节炎猪的病料中分离到2株疑似副猪嗜血杆菌,进行了细菌形态观察、培养特性和生化特性鉴定,根据已报道的副猪嗜血杆菌16SrRNA序列特异性引物进行PCR扩增,得到预期的822bp的基因片断,最终证实为副猪嗜血杆菌。