母细胞产生内含物的芽胞杆菌分析

在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)分离过程中发现有些芽胞杆菌产生与Bt相似的芽胞,但并不形成伴胞晶体,特别是发现它们在芽胞期的母细胞中含有丰富的内含物,对该类菌株的性质需要进一步明确.本研究选择6株该类型的菌株,对其种属、质粒、蛋白谱和杀虫活性等进行了初步分析.芽胞形态和质粒图谱分析结果显示,其与Bt菌株相似;肤指纹图谱分析发现选取的蛋白与蜡样芽胞杆菌(B.cereus)族细菌的蛋白匹配度最高;16S rDNA聚类研究表明,所分离的菌株的确与蜡样芽胞杆菌(B.cereus)族(包括Bc和Bt)同源性最高;从生物杀虫活性测定来看11-1菌株上清液对小菜蛾(Plutella xylostella)的校正死亡率达75.9％,而85-1和11-1菌株上清对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的校正死亡率分别能达到100％和87.9％.本研究结果表明在Bt菌株的分离过程中,对于没有形成晶体但在芽胞形成时期还有内含物的菌株也应加以重视,这些菌株属于B.cereus族,具有潜在利用价值.     

Cry1Ah蛋白活性片段在溶液中的单体和寡聚体杀虫活性分析*

［目的］ 分析NaCl对寡聚化的影响,以及寡聚化对Cry1Ah杀虫活性的影响。［方法］ 利用Superdex 75分子筛,将Cry1Ah活性片段的寡聚体和单体进行分离,通过戊二醛交联试验分析寡聚化程度,结合生物活性测定,分析NaCl对寡聚化的影响以及寡聚化对Cry1Ah毒力的影响。［结果］ 在纯化的组分峰Ⅰ中寡聚体占总蛋白的63.35%。NaCl对寡聚化有促进作用,而寡聚体又以多种形式存在,并且表现出不同的生物活性。寡聚体峰Ⅰ、寡聚体峰Ⅱ、单体峰Ⅲ对棉铃虫的LC50分别为47.192、3.329、3.977 μg/mL。［结论］ NaCl对寡聚化有促进作用,而且,寡聚体的毒力比Cry1Ah活性片段的毒力有不同程度的降低,最多下降49.6倍。推测这种体外形成的寡聚体不同于昆虫体内形成的寡聚体,引起插膜穿孔能力下降,导致毒力不同。     

蛋白质工程在苏云金芽胞杆菌Cry毒素改良中的应用

Bt微生物制剂和转基因抗虫作物已经在全球范围内取得了巨大成功,但是Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限以及害虫对Bt毒素的抗性风险上升等诸多问题,将严重制约Bt在未来农业生产中进一步发挥巨大作用。利用理性设计、非理性设计等蛋白质工程技术对Bt Cry蛋白进行改造是解决这些问题的新途径。通过总结蛋白质工程在Cry毒素改良中的应用情况,分析了存在的问题,并对未来发展动向进行了展望。     

APN1的原核表达及其与Cry1Ac蛋白体外结合

本研究分析了Cry1Ac蛋白与棉铃虫BBMVs的结合情况;并将棉铃虫apn1基因的全长和片段在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达,利用Ligand blotting技术分析原核表达的APN1全长及4个片段与Cry1Ac蛋白的结合情况。结果表明:Cry1Ac蛋白可以与棉铃虫的BBMVs结合;在大肠杆菌中表达的棉铃虫受体蛋白APN1的全长、片段H1(33~257)、H2(258~547)和H3(548~798)可以与Cry1Ac蛋白结合,其中片段H3是首次发现可以与Cry1Ac蛋白结合。本研究的结果也为其他Bt蛋白受体的体外功能研究提供新的借鉴。     

Bt菌株FB的生物学特性及其cry、vip基因型鉴定

菌株FB是1株对小菜蛾Plutella xylostella幼虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis （Bt）。本研究通过扫描电子显微镜、大质粒电泳、总蛋白SDS-PAGE及菌株生长特征观察的方式研究了菌株FB特征,克隆得到了基因cry1Ia、cry1Ea、cry1Ab、cry2Ab和vip3Aa全长,依据全基因组测序结果得到了1个cry8基因部分片段,首次在Bt菌株中同时发现基因cry1类和cry8类,这五种基因推导的氨基酸序列与已知基因序列相比,最高相似性分别为99%、98%、99%、100%、99%,而cry8半长基因与已知基因仅为63%。生测结果表明,蛋白Cry1Ia、Cry1Ea和Cry1Ab对小菜蛾幼虫具有较高杀虫活性。     

基于聚合酶链式反应-高通量测序(PCR-HTS)联用的cry2A基因鉴定方法

cry2基因对多种鳞翅目害虫具有高毒力,且与cry1A类基因无交互抗性,具有重要的应用价值。为了提高苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)cry2杀虫基因资源的筛选和鉴定效率,本研究分析了所有已报到的cry2A基因的保守区,设计了4对通用引物,对2000株Bt菌株基因组DNA混合样品进行了PCR扩增,并利用454高通量测序仪对这些混合扩增产物进行了测序。测序总量有280704条Reads,序列分析结果表明,这些Bt菌株中含有已知的所有9类cry2类基因,其中包括cry2Ae和cry2Ai这2类在国内Bt菌株中未见报道的基因;同时,发现了新型cry2类基因的片段;随后设计特异性引物,扩增获得了半长基因片段cry2-1和cry2-2,进一步利用重叠PCR法获得了全长新基因cry2X,该基因的编码区为1902 bp,编码633个氨基酸;其氨基酸序列与Cry2Ab13蛋白的相似性最高,为93%,属于第三等级的模式基因。建立聚合酶链式反应-高通量测序(polymerase chain reaction-high throughput sequencing,PCR-HTS)联用的基因鉴定方法,具有快速、灵敏、准确、高通量、覆盖范围广等优点,不仅可以对Bt菌株中已知杀虫基因进行鉴定,而且能够发现新的基因,将在Bt基因鉴定、发掘中发挥重要的作用。     

对大丽轮枝菌具有拮抗作用的萎缩芽胞杆菌的分离和鉴定

旨在从新疆棉花主产区的土壤中分离对重要植物病原菌大丽轮枝菌的拮抗菌,鉴定其种类,并探讨其应用前景。采用平板对峙培养法对抗性菌株、发酵滤液进行初步筛选,并对其发酵滤液热稳定性进行测试,采用16S rDNA和gyrB基因序列分析的方法确定该菌的分类地位。共分离出61株对大丽轮枝菌拮抗菌,其中59号菌株拮抗活性强,产色素,其发酵滤液经100 ℃加热5 min后,仍然具有抑菌活性,抑菌圈直径为15.8 mm,盆栽试验结果表明该菌对大丽轮枝菌具有良好的拮抗作用,并能促进棉苗生长。经过16S rDNA和gyrB基因相结合构建的系统发育树分析,结果显示59号等9株菌株为萎缩芽胞杆菌（Bacillus atrophaeus）。这是萎缩芽胞杆菌对大丽轮枝菌有拮抗作用的首次报道。     

对小地老虎具有杀虫毒力的苏云金芽孢杆菌菌株的分离及鉴定

从我国3种典型植被覆盖的6个地区的土壤样品分离得到了348株苏云金芽孢杆菌菌株,采用杀虫活性测定方法从中获得了32株对小地老虎具有高毒力的菌株。利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE蛋白分析法,研究了这32株苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因类型和晶体蛋白表达情况,对小菜蛾、二化螟、棉铃虫的杀虫活性测定也证明了苏云金芽孢杆菌cry基因类型、表达蛋白及杀虫活性间的相关性。     

高效苏云金杆菌KN11杀虫剂产品开发及应用

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）商品化制剂是目前应用范围最为广泛,占据市场容量最大的微生物农药,在对害虫的生物防治中发挥了巨大的作用。本文综述了高效苏云金杆菌KN11产品开发背景、菌株信息、产品特性、登记情况、应用技术等,并对未来KN11产品改进及应用进行了展望。     

苏云金芽胞杆菌sigL基因的缺失对菌体碳氮源利用的影响

sigL基因编码的产物σ54是许多重要代谢途径的转录因子。为研究sigL基因在苏云金芽胞杆菌中的功能,试验分别测定苏云金芽胞杆菌HD-73菌株和sigL基因缺失突变菌株在基本培养基中对不同碳氮源的利用。结果表明,出发菌株和sigL突变体都不能利用果糖、蔗糖、纤维二糖、柠檬酸作为唯一碳源;sigL突变菌株不能利用肌氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和缬氨酸为唯一氮源,说明sigL缺失可能阻碍这些氨基酸参与的代谢途径。β-半乳糖苷酶活性分析表明,调控肌氨酸代谢途径的soxR基因转录活性在sigL突变体中降低,说明sigL是通过调控编码肌氨酸氧化酶的基因簇(sox)而影响菌体对肌氨酸的利用。