柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域（LRR_1和LRR_2）;构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP（GSVIVT01033370001）遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个（OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14）为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系（8个株系）进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降（为野生型的23.12%—75.49%）,其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。     

柑橘CAPS 标记和AS-PCR 引物的开发

 以从GenBank中下载的93 955条甜橙[Citrus sinensis（L.）Osbeck]EST序列为源序列,利用QualitySNP软件包从中挖掘出1 521个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）候选位点。进一步利用酶切位点查找软件WatCut进行分析,发现其中125个SNP为酶切扩增多态性序列（cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS）位点。随机挑选40个CAPS候选位点设计引物,对12个含多种类型的柑橘品种进行分型,以此验证各标记的有效性。同时,还挑选了25个经生物信息学预测可导致其编码蛋白氨基酸序列改变的SNP位点,分别设计出一组等位基因特异PCR（allele specific PCR,AS-PCR）引物,以6个不同类型柑橘品种的DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测,筛选多态性引物。结果显示,40个CAPS候选位点中有26个位点具有酶切扩增多态性,且分型结果稳定,可作为CAPS标记。此外,还筛选获得15组在不同柑橘品种间检测到多态性的AS-PCR引物,重复性好,可有效用于柑橘品种的SNP分型。     

高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量

为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法,通过超声提取,离子交换萃取小柱净化,结合高效液相色谱进行样品测定．色谱条件：EclipseXDB—C18柱（5μm,4．6m／n×150mm,ASilent）;流动相：A为离子对缓冲液（1．05g柠檬酸和1．01g辛烷磺酸钠定容至500mL,pH值为2．6）,B为乙腈,配制比例为90％A＋10％B,流速1．0mL／min,柱温30℃,进样量20止,检测波长240nm．结果表明：三聚氰胺标准曲线为Y=0．009z＋0．3627,相关系数R=0．9998,在0．17—110．0mg／L范围内线性关系良好,方法检出限为0．12mg／L,两个样品三个水平的加标回收率分别为96．34％（RSD=4．76）、84．86％（RSD=7．21）、104．29％（RSD=7．63）和95．31％（RSD=4．39）、89．25％（RSD=3．88）、92．59％（RSD=5．27）．     

转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展

对转基因育种过程中分子检测与鉴定的3个阶段(即外源基因是否整合的检测;目的基因是否转录的检测;目的基因是否有效表达的检测)所涉及的方法进行了概述,并对近期发展起来的新方法作简要介绍。     

柑橘类果树组织总RNA优异且通用的提取方法

分别以柚类、柠檬、甜橙、枳壳和宽皮橘的果皮、果肉、枝皮、老叶、嫩叶、树根、子房、花瓣,尤其是以果胶含量丰富的岩溪晚芦果皮等作试材,将两次LiCl沉淀法加以改良,加入适量CaCl2,找到一种柑橘类果树总RNA优异且通用的提取方法,所得RNA的质量和产量均较高。经差减文库构建、连接、电转化,成功获得了目标片段。     

超量表达CsGH3.6通过抑制生长素信号转导 增强柑橘溃疡病抗性

背景 由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）引起的柑橘溃疡病是柑橘生产上最具毁灭性的一种病害。植物生长素在调控柑橘溃疡病菌引起的寄主侵染部位脓疱形成中起重要作用。生长素早期响应基因GH3通过酰基化吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）调控植物激素动态平衡。前期研究发现柑橘CsGH3.6在调控生长素响应溃疡病侵染中起着重要作用。目的 通过对超量表达CsGH3.6转基因晚锦橙的抗病性、植株表型、细胞和激素变化进行分析,利用RNA-Seq解析CsGH3.6调控的信号通路,探明CsGH3.6调控激素动态平衡影响柑橘溃疡病抗性的内在机制。方法 利用针刺法对离体转基因叶片接种溃疡病菌Xcc,统计接种第10 天时病斑面积和病情指数,以野生型为对照,评价转基因植株的抗性水平;提取感病前后叶片内源激素,利用高效液相色谱技术(high performance liquid chromatography,HPLC )检测转基因植株中激素含量变化;温室中观察转基因植株表型变化;通过测量叶片纵径、横径和厚度分析转基因植株叶型变化特征;制备叶片表皮切片,显微观察表皮细胞和气孔,并统计转基因植株表皮细胞长度和气孔密度;采用RNA-Seq测序技术研究转基因植株转录组变化情况,并利用Nr、Nt、Pfam、COG、SwissProt和gene ontology (GO)数据库注释基因功能,进一步利用KEEG数据库和MapMan软件解析超量表达CsGH3.6影响的重要基因、功能和途径,阐明CsGH3.6调控柑橘溃疡病抗性的分子机制。结果 超量表达CsGH3.6显著增强转基因植株的溃疡病抗性;转基因植株分枝增多且下垂,叶片向上卷曲,变小,颜色浅;转基因植株气孔密度增加,表皮细胞变短;激素含量分析显示,转基因植株自由生长素（IAA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）含量显著降低,而水杨酸（salicylic acid,SA）含量显著增加;转录组测序分析表明,超量表达CsGH3.6显著抑制生长素信号转导相关基因表达,特别是所有注释的Aux/IAA家族基因均下调表达,相反,与生物胁迫相关基因的表达为上调,其中绝大部分基因为病程相关蛋白基因。结论 超量表达CsGH3.6通过酰基化自由IAA抑制生长素信号转导,调控JA和SA的动态平衡,改变细胞和植株的形态建成,从而增强柑橘对溃疡病的抗性。研究结果暗示调控激素动态平衡在柑橘抗病育种中具有潜在价值。     

以无核单胚品种为母本创新柑桔种质技术探索

杂交育种是通过基因重组创新种质的最有效途径之一，近百年来，美国、日本等发达国家相继育成了大量的优良杂交柑桔鲜食品种和砧木品种。我国柑桔杂交育种起步于上世纪50年代，育种者对育种方法和遗传规律进行了系统的探索，现已取得了长足进展，育成了10多个桔橙或桔柚杂种，通称为杂柑。多胚干扰和童期漫长是制约柑桔杂交育种进程的两大关键因子。     

早花枳遗传转化技术体系的建立

以早花枳上胚轴为外植体,通过研究早花枳遗传转化过程中不同的细胞分裂数浓度和不同的卡那霉素筛选压对不定芽的再生频率和GFP表达率的影响,以及不同的成苗方式对不定芽成苗率的影响,建立了早花枳遗传转化技术体系。研究结果表明,在共培养基和诱芽培养基中加入1.5mg/L的细胞分裂数,诱芽培养时以100mg/L卡那霉素作为筛选压,可获得138%的再生频率和32.5%的GFP表达率;早花枳在含有不同浓度NAA的 生根培养基上生根能力都较差,而以酸桔为砧木,通过试管内茎尖嫁接可获得98%的不定芽成活率。     

利用SSR标记鉴定柚和杂柑品种

采用SSR技术,从105对柑桔SSR引物中,筛选出10对在柑桔大类品种间多态性位点丰富、带型清晰、重复性好的SSR引物.利用其中5对SSR引物对5个柚和7个杂柑品种DNA进行PCR分析,共扩增出35条谱带,其中27条谱带呈现多态性,引物多态性带纹比例均在60%以上.扩增片断的大小集中在100 bp～500 bp之间.分别针对柚和杂柑品种筛选出两个高效的引物组合(SSR17、SSR15、SSR16、SSR12与SSR17、SSR18、SSR16),利用这两组引物成功构建出了我国主推的5个柚和7个杂柑品种的特征指纹图谱.并应用指纹图谱自动识别软件Gel 2.0对各品种指纹图谱进行识别,建立了相应品种的指纹模式图谱库.     

非洲菊的组织培养

非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus)为菊科宿根草本。我们经过多次的试验,成功地对其进行了组织培养。 1.外植体的采集和消毒取较大的未开放的花蕾,用自来水洗净,再用0.1％的升汞处理8分钟,最后用无菌水冲洗4～5次。把花蕾剥开,接种在培养基上。 2。培养基和培养方法培养基为MS BA1 IBA0.5 糖4％ 琼脂9％,pH 5.8,培养温度为27～28℃,光强为2000lux。2周后,花瓣基部开始膨大并逐渐产生愈伤组织。1个月后,愈伤组织逐渐分化出芽。将愈伤组织和芽接种在MS BA0.5 IBA0.2 糖4％ 琼脂9％(pH