棉铃虫复眼中Clock生物钟基因的昼夜表达模式

【目的】克隆并分析棉铃虫(Helicoverpa armigera)复眼Clock(Clk)生物钟基因的c DNA序列,探讨棉铃虫复眼中Clk生物钟基因的昼夜表达模式及其表达水平的影响因子,以确认其在复眼中是否起着调节生物节律的功能,为理解复眼中生物钟基因网络提供理论参考。【方法】以2日龄棉铃虫复眼为试验材料,采用RT-PCR和RACE末端扩增技术克隆棉铃虫Clk生物钟基因。利用生物信息学软件对得到的棉铃虫CLK氨基酸序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,检测棉铃虫成虫不同器官(头、胸、腹、足、翅、脑、触角、复眼)中Clk生物钟基因的表达水平;通过设置不同的光周期环境,检测复眼中Clk生物钟基因的昼夜表达模式;通过在暗期设置6 h不同波段光(UV、蓝光和绿光)照射,检测复眼中Clk生物钟基因的表达水平;通过设置棉铃虫雌雄蛾交配处理,检测交配结束0 h和3 h复眼中Clk生物钟基因的表达水平;通过饥饿处理棉铃虫雌雄蛾,检测复眼中Clk生物钟基因的表达水平。【结果】克隆得到棉铃虫Clk生物钟基因的c DNA序列,命名为He CLK(Gen Bank登录号为KM233158),开放读码框1 860 bp,编码619个氨基酸组成的多肽,理论推测分子量(Mw)为69.32 k D,等电点(p I)为5.71。推导得到的氨基酸序列具有3个跨膜拓扑结构,包含多个昆虫CLK蛋白的保守区域(PAS和HLH),其与甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)的同源性较高,分别为97%和74%。与点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)和马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)的同源性较低,分别为53%和52%。q RT-PCR结果表明在检测的成虫器官中,He CLK在复眼中表达水平最低,触角中表达水平最高。在14L﹕10D光周期下,复眼中He CLK的表达量在白天增高,夜晚下降。生物钟基因的昼夜表达模式在1 d黑暗下可以持续,而在持续黑暗下固有表达节律消失。复眼中He CLK的表达水平在6 h光照后上调,但不同波段光照射无显著性差异。复眼中He CLK的表达水平在交配后有下调趋势,在雄蛾交配后表达水平显著性下降。复眼中He CLK的表达水平在饥饿处理后无显著性变化。【结论】成功从夜蛾棉铃虫的复眼中克隆得到Clk生物钟基因,由Clk生物钟基因推导得到的氨基酸序列具有典型的CLK蛋白特征,且与昆虫CLK蛋白同源性较高。在检测的棉铃虫成虫器官中,He CLK在复眼中的表达水平最低。He CLK在外周组织复眼中的表达水平受蛾类自身节律、光照和蛾类生理状态的影响,证实棉铃虫复眼中He CLK在调节生物节律方面具有重要作用,但生物钟基因网络在复眼与中枢神经中是否类似有待进一步深入研究。     

异色瓢虫胁迫对棉铃虫生长发育及压力蛋白基因表达的影响

【目的】明确不同食源异色瓢虫(Harmonia axyridis)胁迫对棉铃虫(Helicoverpa armigera)生长发育和变态发育的影响,探讨棉铃虫是否能感知并分级捕食风险、能否在生长发育和变态发育上体现出权衡效应;明确长时和短时胁迫对棉铃虫压力蛋白基因表达的影响,探讨异色瓢虫胁迫能否引起棉铃虫分子水平上的生理反应。【方法】通过设置7种不同食源的异色瓢虫胁迫处理(饥饿处理、虾卵处理、棉铃虫幼虫处理、棉铃虫卵处理、蚜虫处理、蚜虫对照处理、对照处理),观察记录棉铃虫在胁迫下的生长发育(幼虫历期、蛹历期、雌雄蛾寿命、总寿命)和变态发育(蛹重、化蛹率、羽化失败率、卷翅率)指标;设置长时(1龄幼虫至3日龄成虫)和短时(15 min至6 h)异色瓢虫胁迫处理,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测棉铃虫压力蛋白基因(即热激蛋白基因)Hsp70和Hsp90及热激同源蛋白基因Hsc70在胁迫后的表达水平变化。【结果】在捕食性天敌异色瓢虫的胁迫下,棉铃虫幼虫历期、蛹期、雌雄蛾寿命、总寿命均显著性缩短,蛹重和化蛹率显著性下降,成虫卷翅率显著性升高,而羽化失败率无显著性变化。在不同食源的天敌胁迫下,棉铃虫幼虫历期在异色瓢虫取食蚜虫时最短,蛹历期在瓢虫取食棉铃虫卵时最短,总寿命在瓢虫取食虾卵时最短,而雌雄蛾寿命在不同食源天敌胁迫下未表现出显著性差异;棉铃虫成虫卷翅率在瓢虫取食棉铃虫卵时最高,而蛹重、化蛹率、羽化失败率在不同食源天敌胁迫下未表现出显著性差异。压力蛋白基因Hsp70和Hsp90在短时胁迫下(Hsp70:30min至3 h;Hsp90:15 min、1.5 h、2 h、6 h)表达水平显著性上调,热激同源蛋白基因Hsc70在长时胁迫下(5龄幼虫、预蛹、雄蛹、雌蛾阶段)表达水平显著性上调。【结论】在面对捕食性天敌异色瓢虫长时胁迫作用下,棉铃虫各生长发育阶段均出现缩短的现象,即棉铃虫为躲避被捕食风险表现出了发育加速的现象,而快速的生长发育在一定程度上干扰了变态发育,导致蛹重和化蛹率下降,成虫卷翅率提高,符合权衡效应。棉铃虫对不同食源的天敌胁迫具有不同程度的敏感性,即棉铃虫对潜在的捕食风险可能存在一定的分级能力,但这种分级能力没有得到规律性体现。异色瓢虫胁迫能够引起棉铃虫分子层面的生理反应,导致压力蛋白基因的表达上调,其中压力蛋白基因Hsp70和Hsp90受到短时胁迫的反应较为明显,而热激同源蛋白基因Hsc70受到慢性胁迫刺激的反应更为显著。     

棉花不同组织DNA的不同提取方法比较

[目的]研究棉花不同组织DNA提取的最佳方法。[方法]以棉花嫩叶、种子、黄化苗作为研究对象,比较CTAB法、SDS法、SDSCTAB法提取DNA的效果。[结果]若对DNA的量没有要求,棉花嫩叶、种子、黄化苗等组织均应选用SDS-CTAB法提取DNA。若对DNA的量有一定要求,如浓度需大于100 ng/μl,质量大于20 000 ng的情况下,针对不同试验材料推荐使用的提取方法是:棉花嫩叶用CTAB法,棉花种子SDS法,棉花黄化苗CTAB法。[结论]为快速高通量地检测转基因棉花基因漂移距离和频率提供参考。     

球孢白僵菌对马铃薯块茎蛾的毒力及其与常用农药的生物相容性测定

室内测定了从云南分离的7株球孢白僵菌对马铃薯块茎蛾幼虫的毒力,结果表明,在接菌孢子浓度为10⁵个/mL和10⁷个/mL下,接种后7d马铃薯块茎蛾幼虫累积死亡率分别为23.3%～70.0%和33.3%～86.7%,添加吐温80的清水对照死亡率仅为3.3%。筛选出毒力较高的Bb7001、Bb7004、Bb8001 3个菌株,其中菌株Bb8001对马铃薯块茎蛾幼虫的毒力最高,在孢子浓度1×10⁵、1×10⁷个/mL下,第7天的累计死亡率分别为70.0%和86.7%,其毒力回归方程Y=0.366X+3.409(R=0.956),剂量效应LC₅₀=2.24×10⁴个/mL,孢子浓度10⁷个/mL下的LT₅₀为4.3d。测定了毒力较高的菌株与12种农药的生物相容性,结果表明在供试农药推荐用量及其101、00倍稀释液下,球孢白僵菌Bb7001、Bb7004、Bb8001的3个菌株孢子在含所选农药的营养液中生物相容性良好的农药有:苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂(Bt)、10%吡虫啉可湿性粉剂、2.5%菜喜悬浮剂及松毛虫病毒可湿粉剂,可配伍使用;而阿维菌素、农安、卡死克、抑太保对球孢白僵菌有很强的抑制作用,应避免配伍使用。     

胚轴切断法诱导棉花抗棉铃虫及其生化机制研究

诱导抗虫棉株对棉铃虫营养代谢功能的影响表明,胚轴切断法结合假单胞杆菌（Ｄ－２２５１）诱导处理的棉株可使棉铃虫相对生长率（ＲＧＲ）、相对取食量（ＲＣＲ）和近似消化率（ＡＤ）明显降低,分别降低２２．９５％、２６．１２％和２７．２３％,仅用胚轴切断法处理的棉株可使ＧＲＧ、ＲＣＲ和ＡＤ分别降低１７．２５％、２１．４４％和４．０９％。对诱导处理棉株体内植物多元酚和抗虫萜烯类的测定结果表明,经过胚轴切断法后,     

Bt cry I A（c） 杀虫基因向棉内生细菌Bacillus cereus染色体中整合的研究

将来自Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki的Bt CRy I A(c) 杀虫基因通过综合质粒载体pBC601，整合到棉花（Gossypium hirsutum)优势内生细菌Bacillus cereus(Bc9002)的染色体上，得到的工程菌对棉铃虫（Helicoverpa armigera Hb.)有杀虫活性。此综合质粒含有能在营养期表达Bt cry I A(c) 基因的强启动子，cry I A(c)杀虫基因，四环素抗性标记基因tet^r 8.0kb的EcoR I-Nco I B.cereus染色体片段。将综合质粒通过电击导入B.cereus(Bc9002)中，综合质粒因含B.cereus染色体片段，可与B.cereus染色体发生同源重组，从而将Bt cry I A(c)基因整合到B.cereus的染色体上。通过对转化子的DNA酶切分析，PCR扩增，SDS－PAGE凝胶电泳检测，ELISA检测，电镜观察，毒力测定。结果表明Bt cry I A(c)基因已经整合到内生细胞Bc9002的染色体上，并可高效表达。     

淡紫拟青霉发酵液生理活性的初步鉴定(简报)

淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)是重要的线虫寄生真菌,对根结线虫属、球孢囊线虫属、米穿刺线虫属和假根结线虫属等多种线虫有较强的侵染力,已在美国、巴西、菲律宾等数个国家用于防治多种植物线虫。据 Bakalivanov(1966)报道,淡紫拟青霉的代谢产物有促进大麦幼苗生长的作用,可能含有植物生长激素类物质。因此,应用该菌防治     

棉酚和可水解丹宁含量与棉花抗棉铃虫的关系

本研究以经过大田多次抗虫鉴定的柿花品种为材料。分析并阐明了棉花品种的各虫食部位内棉酚和可水解丹宁的含量与棉铃虫幼虫营养指标的相关性.结果表明,棉酚和可水解丹宁是影响幼虫生长的重要抗生物质,棉花对棉铃虫化学抗性强弱很大程度上取决于棉花虫食部位内二者含量的高低.苞叶、花萼和花瓣内富含抗虫物质,是重要的抗虫部位.棉酚和可水解丹宁含量在不同的品种内呈一定的负相关性.抗虫品种 HG-BR-8以高浓度的棉酚为主要扰性因子,而抗虫品种花苞棉则通过棉酚和可水解丹宁双因子起作用.     

球形芽孢杆菌Bs-8093发酵上清液对青枯雷尔氏菌的抑菌作用

研究发现球形芽孢杆菌Bs-8093菌株的发酵上清液对青枯雷尔氏菌强致病力菌株有抑制作用,不同配方发酵上清液对青枯雷尔氏菌强致病力菌株F．1．2-010618-07V的校正抑制率不同,最高达82．94％,最低44．93％。采用正交试验对球形芽孢杆菌Bs-8093菌株发酵培养基进行筛选,结果表明:棉籽粉、牛肉浸膏和初始pH对 Bs-8093菌株活菌数及其发酵上清液对青枯雷尔氏菌的校正抑制率都有显著影响。试验获得的最佳摇瓶配方为: 棉籽粉5．0％、牛肉浸膏0．3％(质量分数),初始pH 7．4。     

油菜小麦邻作模式对麦蚜主要天敌种群动态以及小麦生产的影响*

麦蚜是危害我国小麦生产的重要害虫。本试验探索了油菜小麦邻作模式以及小麦单作模式对麦蚜主要天敌发生的影响,以小麦和油菜交界处向两边各在0、2、4、6、8、16 m处设立试验小区,记录麦蚜主要天敌发生数量以及测定小麦株高、穗长、穗重、千粒重,揭示油菜小麦邻作模式对小麦生产的影响。结果表明：随着油菜的成熟,瓢虫逐渐向油菜小麦邻近处转移,且迁移的最有效距离为4 m;对邻作小麦田蚜茧蜂数量最高峰当日数据进行分析,发现除最高的0 m（2009年）和4 m（2010年）处外,其他各距离之间不存在显著差异,而单作田各距离之间蚜茧蜂数量上的差异不明显;相比于小麦单作模式,油菜小麦邻作显著提高了小麦的株高、穗长、穗重、千粒重。总之,油菜小麦邻作模式有利于麦蚜主要天敌向小麦田转移,并能提高小麦的产量和生物量。