两个苹果乙烯反应因子MdAP2D4与MdAP2D19的序列分析及原核表达

【目的】克隆苹果中的两个ERF（ethylene responsive factor）转录因子,对其序列与表达进行分析;并进一步构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达,为解析两基因的抗病功能及作用机制奠定基础。【方法】首先,将抑制性消减杂交筛选到的EST序列进行BLAST比对,根据比对获得的MdAP2D4与MdAP2D19的cDNA序列设计引物进行克隆;然后,利用MEGA4.1软件将两个ERF蛋白与拟南芥的AP2家族蛋白进行聚类分析,对保守的AP2功能域的氨基酸序列进行分析;并进一步利用RT-PCR检测两基因对外源MeJA的响应;最后,将两个基因分别连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21进行诱导。【结果】MdAP2D4与MdAP2D19两个基因均与拟南芥B3组ERF亲缘关系最近,在叶片中表达较高,都能被外源的MeJA诱导表达。SDS-PAGE检测结果表明,两个基因的融合蛋白均能够被IPTG诱导表达。【结论】 MdAP2D4与MdAP2D19为 B3组ERF转录因子,外源MeJA能够诱导其表达。     

苹果抗性相关的谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1的生物信息学和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus domestica Borkh.）中抗苹果轮纹病相关的编码谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1,研究其在不同组织器官及不同逆境处理条件下的表达特性,为解析该基因的抗逆功能奠定基础。【方法】基于抗轮纹病相关的EST序列,通过在NCBI进行比对,得到一个谷胱甘肽转移酶（GST）基因相关的EST片段;然后在苹果基因组数据库中进行比对,获得该GST的编码框序列（coding sequence,CDS）,同时,设计RACE引物,克隆该基因的UTR序列;利用MEGA5.0软件对该GST蛋白与拟南芥GST家族蛋白成员进行系统进化树分析,使用DNAMAN软件对该蛋白的分子量、等电点等进行预测,并对其氨基酸序列进行分析;采用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的表达以及该基因在盐、模拟干旱和苹果斑点落叶病原菌处理条件下的表达特性;克隆该基因的启动子,利用PlantCARE软件在线分析该基因启动子上的顺式作用元件。【结果】进化树分析显示该GST与拟南芥中GST家族的U亚家族成员亲缘关系最近,故被命名为MdGSTU1;MdGSTU1的CDS为666 bp,编码221个氨基酸残基,其蛋白分子量为25.41 kDa,等电点为5.28;RACE结果显示该基因3'UTR区域为135 bp;蛋白序列及结构分析显示,其与拟南芥GST家族蛋白相同,该蛋白也包含保守的谷胱甘肽-S-转移酶的N端及C端结构域;PCR结果显示,MdGSTU1在根、茎、叶、花、果各组织中均有表达,但根中的表达水平最高,同时,该基因能够被150 mmol·L^-1 NaCl和20%的PEG诱导表达,均在1 h时表达量达到最高值;另外,苹果斑点落叶病原菌也能诱导MdGSTU1的表达,表达量在病菌处理8 h时达到最大;启动子分析显示MdGSTU1启动子区域含有多个抗性相关的作用元件,其中包括ABA响应元件、厌氧响应元件、GA响应元件、SA响应元件、JA响应元件以及防御和逆境响应元件;此外,该启动子上还包含多个MYB转录因子结合位点。【结论】MdGSTU1属于植物tau亚家族（GSTU）成员,生物及非生物逆境胁迫均可诱导该基因的表达。     

苹果MdJAZ1基因表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果茉莉酸信号途径阻遏因子基因MdJAZ1,并对其表达及蛋白互作进行分析,为进一步研究MdJAZ1的功能奠定基础。【方法】以TIFY及Jas功能域为探针,在苹果基因组中进行比对,获得多个同源基因,对其中的一个基因设计引物进行克隆;利用DNAMan软件对该基因编码蛋白的分子量、等电点进行预测;利用SMART在线分析软件对该蛋白的功能域进行分析;利用MEGA5.0对该蛋白与拟南芥JAZ家族蛋白构建系统发育树;利用荧光定量PCR分析该基因在苹果不同组织器官、茉莉酸甲酯及创伤处理下的表达情况;利用PlantCARE在线软件分析该基因启动子区域的顺式作用元件;利用酵母双杂交系统检测MdJAZ1蛋白的二聚化及其与拟南芥AtCOI1蛋白的互作关系。【结果】MdJAZ1开放阅读框为1 149 bp,编码382个氨基酸残基,其蛋白的分子量为40.536 kDa,等电点9。氨基酸序列分析显示,该蛋白包含保守的TIFY及Jas结构域;系统发育树分析显示,MdJAZ1蛋白与拟南芥JAZ家族AtJAZ3、AtJAZ4亲缘关系最近;qPCR结果显示,MdJAZ1在苹果的根、茎、叶、花及果实等组织中都有表达,但表达水平存在明显差异,其中根中的表达量最高,果实中的表达量最低;该基因还能被茉莉酸甲酯及创伤处理诱导表达,均在1 h内达到最高表达水平;启动子分析显示,MdJAZ1启动子中包含多个ABA、乙烯、抗病及逆境胁迫等响应元件,此外,还包含多个MYB结合位点;酵母双杂交结果显示,MdJAZ1蛋白能与其自身相互作用形成同源二聚体,还可与拟南芥中同源性较近的AtJAZ3、AtJAZ4蛋白相互作用形成异源二聚体,并且在冠菌素存在时,MdJAZ1蛋白可与拟南芥F-box蛋白AtCOI1相互作用。【结论】MdJAZ1受茉莉酸甲酯及创伤诱导表达,其蛋白能形成同源及异源二聚体,且在冠菌素存在时可与AtCOI1互作。     

苹果砧木对低氮胁迫的响应及适应性评价

  【目的】  明确低氮胁迫对7种苹果砧木生长及生理生化特性的影响,为耐低氮苹果砧木的选育和氮高效吸收利用生理机制的研究提供理论依据。  【方法】  沙培试验以改良1/2 Hoagland营养液为基础,设定硝态氮含量正常水平(NN,5 mmol/L NO₃–)和低氮胁迫(LN,0.5 mmol/L NO₃–)两个处理,供试苹果砧木包括矮化砧T337、Nic29、Pajam2、B9、71-3-150和半矮化砧青砧2号、乔化砧山定子(Malus baccata L. Borkh.),均为一年生健康苗。处理60天后,测定砧木新稍生长、物质积累、根系形态、叶片和根系硝酸还原酶活性、植株氮累积量,利用隶属函数模糊评价法比较不同苹果砧木的耐低氮能力。  【结果】  在正常供氮条件下,乔化砧山定子的植株总干重和氮利用效率明显高于其他5种矮化砧;矮化砧中Pajam2的植株干物质积累量最大,B9的根冠比最高;矮化砧Nic29的新梢生长速率和叶片硝酸还原酶(NR)活性显著高于其余6种砧木;半矮化砧青砧2号的根系NR活性显著高于其余砧木,有利于植株的氮累积。与正常供氮相比,低氮条件下,T337、Nic29和山定子的新稍生长均受到显著抑制;B9、Pajam2和青砧2号的新稍生长未受明显影响;而71-3-150的新稍生长速率提高,叶面积增大,根系中干物质积累量增加,植株根冠比显著增大,为正常供氮处理的2.59倍。低氮条件下,T337、B9、Pajam2和山定子根系总表面积和总根长均显著降低,T337降幅最大;而71-3-150的根系总表面积、总根长、根系总体积、根尖数等根系参数显著升高;Nic29的根系总表面积、总根长和根总体积升高,但根尖数减少,根系分枝数也升高。低氮胁迫条件下,苹果砧木叶片NR活性减小,B9、Nic29、Pajam2和山定子根系中NR活性较正常供氮分别提高了3.70、5.16、2.85和5.14倍。低氮条件下,T337、B9、Pajam2和青砧2号的叶片、茎干和根系中氮累积量均趋于降低,植株氮累积量减小,青砧2号降幅最大,但B9、Nic29、Pajam2和青砧2号的氮利用效率均显著提高,青砧2号的增幅最大;而71-3-150的根系和植株氮累积量均显著升高。基于7种苹果砧木生长、根系参数、氮代谢酶活性、氮累积量和氮利用效率等19个指标的耐低氮胁迫指数,结合隶属函数模糊评价法和聚类分析将7种砧木分为3种耐性类型:第Ⅰ类为耐性强的砧木(71-3-150);第Ⅱ类为耐性较弱的砧木(Nic29、山定子、B9和青砧2号);第Ⅲ类为耐性最弱的砧木(Pajam2和T337)。  【结论】  在正常供氮条件下,乔化砧木山定子和半矮化砧青砧2号在植株干物质积累、根系发育和养分吸收利用等方面均强于矮化砧,但其对低氮胁迫适应性较弱。低氮条件下,苹果砧木通过提高氮利用效率适应养分亏缺,耐性强的砧木植株生长受抑制程度较小,并通过调节自身生理特性,增加根系中的物质和养分积累,提高植株根冠比,以适应低氮环境。     

不同品种苹果幼树对氮磷亏缺的生理响应

【目的】探究不同苹果品种对低磷、低氮及低磷低氮胁迫的生理响应,为养分高效利用苹果品种的选育提供理论基础。【方法】采用沙培盆栽试验方法,供试材料为三年生‘嘎拉’/M9T337、‘富士’/M9T337和‘蜜脆’/M9T337矮化自根砧苹果(M9T337为矮化砧木)。以改良1/2Hoagland营养液为基础,设置正常、低氮两个氮水平(NO₃~–15、1.5 mmol/L)和正常、低磷两个磷水平(H₂PO₄~–1.0、0.1 mmol/L),共配置适氮适磷、适氮低磷、低氮适磷和低氮低磷4个处理。测定了苹果树体生长、叶片光合作用和叶绿素荧光参数,分析了苹果叶片氮、磷代谢相关酶活性,树体氮、磷累积量。【结果】与适氮适磷相比,适氮低磷和低氮适磷条件下,‘嘎拉’和‘蜜脆’的植株总干物质量均显著降低,‘富士’的植株总干物质量有显著增加;适氮低磷条件下的‘嘎拉’、‘富士’和‘蜜脆’叶绿素b含量均显著降低,F_o呈升高趋势,但‘嘎拉’和‘富士’的F_v/F_m显著升高且P_n...     

干旱胁迫下核桃生理适应性及抗性指标筛选

以早实核桃辽宁1号、香玲嫁接苗为试材，采用盆栽控水-自然干旱的方法进行干旱处理，测定干旱处理0、3、6、9、12、15、18 d的10个生理生化指标，利用隶属函数值和综合抗旱指数等进行分析评价，以明确其干旱适应性变化，筛选简单有效的核桃抗旱指标。结果表明：辽宁1号和香玲叶片相对含水量随干旱胁迫程度的增加逐渐降低；叶片相对电导率、水分饱和亏缺、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量随干旱胁迫程度的增加逐渐升高；SOD、POD、CAT活性随干旱胁迫程度增加呈先上升后下降的趋势。综合分析评价表明，辽宁1号抗旱性较香玲强，其中水分饱和亏缺、SOD活性、POD活性、脯氨酸含量、CAT活性5个指标可以较好地反映核桃品种的抗旱能力。     

核桃 JrCOR413 基因家族鉴定与表达分析

为解析核桃COR413基因家族在响应冷胁迫中的作用，本研究利用生物信息学技术在核桃全基因组筛选并鉴定COR413家族基因，对该家族成员进行结构和表达分析。结果表明，核桃COR413基因家族包含6个基因，编码7条蛋白，分布在4条染色体上，开放阅读框为549～804 bp，翻译蛋白范围为182～267个氨基酸，等电点为8.15～9.93，全部为碱性稳定蛋白；含有典型的WCOR413高度保守的结构域。聚类分析发现，该类基因可与拟南芥高度同源，并分为2个亚组。在低温胁迫48 h后经转录表达分析，JrCOR5在2个核桃品种中显著升高，并且在花器官和嫩茎转录表达较高；结合qPCR分析，JrCOR5在冷胁迫48 h显著升高，达到90倍以上。因此，推测JrCOR5可能在核桃响应冷胁迫过程中起到重要作用。本研究结果将为解析核桃JrCOR413基因家族成员在响应冷胁迫过程中的分子机制研究奠定基础。     

晚白海棠×华月苹果杂交种实生苗若干性状的遗传分析

以苹果品种晚白海棠为母本、栽培品种华月为父本构建的杂交群体为试材，通过对杂交种实生苗的果实、叶片等若干性状的遗传变异和遗传倾向进行分析，鉴定苹果若干性状的遗传规律，以期为杂交育种亲本的选配提供参考。结果表明，晚白海棠×华月苹果杂交种实生苗存在丰富的遗传多样性。杂交种实生苗的单果质量、果实横径、果实纵径、果形指数、叶片长度、叶片宽度、可溶性固形物含量等性状均呈正态分布，单果质量、果梗粗、果实横径、果实纵径间呈极显著正相关。杂交群体单果质量的变异系数为41.20%,杂交群体的单果质量更倾向于小果型母本晚白海棠，低于低值亲本后代占比超过84%,表现出性状退化的趋势。杂交种实生苗果实果形主要以双亲果形为主，果形指数的变异系数只有6.74%,有向圆形果变异的趋势。果形指数、色差指数、可溶性固形物等重要性状的遗传传递力均达到90%以上。可溶性固形物低于低值亲本比率为44.09%,可滴定酸低于低值亲本比率达65.59%,但在杂交种实生苗中也出现了一些性状表型优于高值亲本的株系。