褐色橘蚜中柑橘衰退病毒实时荧光定量 RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,测定褐色橘蚜（Toxoptera citricida）中柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）含量。【方法】根据CTV CP25保守序列,设计特异性引物HD-F/R,通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性检验,评价该方法的可行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR方法最低检测限为9.0拷贝/μL,其灵敏度是常规RT-PCR的100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关性系数为0.998,扩增效率达104.7%。批内和批间变异系数均小于3.24%,表明该方法重现性好。获毒24 h单头橘蚜中CTV最低含量为2.5×103拷贝,最高含量为1.24×106拷贝。【结论】本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够准确检测褐色橘蚜中的CTV,可用于研究褐色橘蚜-CTV-寄主互作关系及CTV的流行。     

白皮丝瓜新品种新秀的选育

新秀是以Z0931为母本,以B9704为父本配制而成的白皮丝瓜一代杂种。植株生长势强,早熟,早春栽培主蔓第1雌花节位为第7~8节;果实中棒形,纵径31~35 cm,横径5.1~5.4 cm,单果质量295 g左右,外皮白绿色、光滑,果肉紧密,耐贮运;田间对白粉病、疫病的抗性强于对照白玉香。667 m2前期产量1 170 kg,总产量4 000 kg,适合湖南、湖北、江西、浙江等地大面积栽培。     

果树病毒载体研究进展

植物病毒载体作为重要的研究工具被广泛运用于蛋白表达、基因沉默等研究,当前普遍使用的是以烟草花叶病毒载体等为代表的草本植物病毒载体,但其大多不能侵染果树,且稳定性较差,容易丢失插入的外源基因,因此该类载体无法满足果树等多年生植物研究的需要。近年来新兴的果树病毒载体可解决这些难题,为此作者对果树病毒载体的研究进展和发展方向进行综述。当前国内外取得的研究成果主要包括：（1）通过掌握柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒、葡萄病毒A和葡萄卷叶伴随病毒等果树病毒的传播途径、寄主范围、致病力分化、基因功能和表达策略等特性,采用体外转录或农杆菌介导的方式获得了上述果树病毒的全长侵染性克隆。在此基础上,通过在病毒外壳蛋白基因与其邻近的上游基因之间插入外源基因（包括荧光蛋白基因和β-葡萄糖醛酸酶基因等报告基因）,并用该病毒外壳蛋白基因的启动子或其他异源启动子驱动外源基因表达的方式,将上述6种果树病毒的全长侵染性克隆改造成为病毒载体;（2）运用果树病毒载体明确了柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒和葡萄卷叶伴随病毒在植株中的分布、移动规律,及其在细胞中的定位。探寻了柑橘衰退病毒在大翼来檬上产生茎陷点症状的原因,以及交叉保护防治柑橘衰退病的主要机理。果树病毒载体还被作为病毒诱导的基因沉默载体用于基因功能和防病研究;（3）通过选用本地已经存在,且无虫传能力的弱毒株,以及对控制病毒致病和媒介传播能力的基因进行敲除、突变可以解决果树病毒载体研发过程中所遇到的安全风险。由于有些果树病毒仅分布于植株的韧皮部,因此限制了其作为病毒载体在植株中表达外源基因的范围,但由这类果树病毒构建的病毒载体稳定性极高,并且通过添加分泌信号肽基因等方式可以扩大表达产物在植株中的分布和作用范围,因此其在果树病毒研究方面仍然具有很高的应用价值。此外,采用不同病毒来源的异源启动子代替同源重复区来驱动外源基因的表达,可以进一步提高果树病毒载体的稳定性。     

柑橘衰退病毒研究进展

柑橘衰退病毒引起的柑橘衰退病是一种广泛分布于世界各柑橘主产区的重要柑橘病毒病害,对柑橘产业的为害极大。随着我国柑橘产业的快速发展,近年来柑橘衰退病在我国多个柑橘产区爆发,造成了严重的经济损失。本文就柑橘衰退病毒的起源、类型、传播方式、蛋白功能、病毒与寄主的互作关系、茎陷点症状形成的机理和防治方法作一综述,以期为今后有效防控柑橘衰退病提供参考。     

大雅柑枯斑病斑的病原鉴定及防治药剂的筛选

2020年春季,于重庆市长寿区柑橘园内采集大雅柑典型枯斑病果实,采用组织块分离法分离得到菌株CS11,对其进行形态学和分子生物学鉴定,确定CS11为Stagonosporopsis cucurbitacearum。向健康的柑橘盆钵苗喷洒CS11孢子悬液可致植株患病,从患病样品中分离得到菌株CS11,确认CS11是致病病原菌;CS11对大雅柑(Citrus reticulata.cv. dayagan)、有核沃柑(Citrus rtemple× Dancy)、塔罗科血橙(Tarocco blood orange(Citrus sinensis(L.) Osbeck))和尤力克柠檬(Citrus limon)的叶、枝、果实均具有致病性。室内药剂筛选结果显示,75%肟菌?戊唑醇水分散粒剂、60%唑醚?代森联可湿性粉剂、450 g/L咪鲜胺乳油、37%苯醚甲环唑可湿性粉剂、11.5%吡唑嘧菌酯乳油5种杀菌剂对CS11有较好的抑制作用,其中 75%肟菌?戊唑醇水分散粒剂、60%唑醚?代森联可湿性粉剂、37%苯醚甲环唑可湿性粉剂、11.5%吡唑嘧菌酯乳油等4种药剂的EC50值均小于10 mg/kg。     

不同类型柑橘中黄脉病毒衣壳蛋白基因的保守性及复制水平

为研究不同柑橘品种对柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)变异的影响,将CYVCV毒株CQ01嫁接接种于4类共35个柑橘品种,对不同植株中CYVCV的衣壳蛋白(CP)基因进行分析,结果发现仅有少数位点发生了变异。运用RT-qPCR技术检测不同柑橘品种中CYVCV的相对含量,发现甜橙类品种中CYVCV的相对含量最高,墨西哥来檬中CYVCV的相对含量最低。植株中CYVCV的含量与其症状不存在明显的关联。     

应用RT-PCR检测温州蜜柑萎缩病毒

温州蜜柑萎缩病是以日本为主的少数亚洲国家柑橘上的重要病毒病害,多数柑橘品种隐症带毒,不易发现,对其早期准确快速检测尤为重要.以毒源植株的叶、枝皮为材料,对提取的总RNA和总核酸进行反转录和PCR扩增,通过SDV特异引物的设计与筛选,反应体系与反应程序的建立与优化,扩增得到一个251 bp的特异片段,测序结果与日本Iwanami报道的SDV序列同源性为99.6%.RT-PCR检测体系的灵敏度为100ng,同时应用该检测体系可以全年检测到毒源植株嫩叶、嫩皮、老叶、老皮中的SDV.     

柑橘衰退病毒含量对其蚜传效率的影响

为明确毒源植株和蚜虫中柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)的发生情况与蚜虫传播CTV能力的关系,将褐色橘蚜、棉蚜、橘二叉蚜和绣线菊蚜置于分别感染了4个CTV分离株的锦橙上取食24 h后,运用巢式RT-PCR和实时RT-PCR检测蚜虫和锦橙的带毒情况,并分析蚜虫的传毒能力。结果显示,蚜虫中CTV的平均带毒率为0.76~0.84,其中棉蚜的最高,其次为绣线菊蚜、褐色橘蚜和橘二叉蚜。锦橙中各CTV分离株的含量差异不大,与蚜虫传毒效率间无显著相关性;也未发现蚜虫带毒率与其传播CTV能力之间存在相关性。蚜虫体内CTV的含量为5.36×103±2.33×103~2.01×106±3.67×105拷贝,褐色橘蚜中含量最高,其次为棉蚜、橘二叉蚜和绣线菊蚜;且高蚜传能力CTV分离株在褐色橘蚜体内的含量远高于低蚜传能力分离株。表明蚜虫体内CTV的含量可能与蚜虫传毒能力有关。     

利用RT-PCR检测柑桔碎叶病毒的研究

柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV) 的传统检测方法是指示植物测定,该方法检测周期较长,且需要温、网室等配套设施;酶联免疫吸附方法(ELISA)可用于检测CTLV,但使用的是针对苹果茎沟病毒(ASGV)的抗体,虽然CTLV和AS- GV的亲缘关系已经得到证实,但到目前为止没有对中国的分离株进行实验验证,这在一定程度上影响了结果的可靠性。本研究应用Halistones 等建立的半巢式RT-PCR技术对已感病柑桔品种进行了周年检测,现将研究结果报道如下。     

轻量化神经网络在远洋鱿钓检测技术中的应用

中国远洋鱿鱼捕捞技术比较单一,智能化的鱿鱼捕捞技术对远洋渔业资源统计至关重要。在智能化鱿鱼捕捞作业过程中,以YOLOV3算法检测时,其特征提取网络Darknet53模型参数量较大,模型输出权重存储量较高,降低了检测速度。为此,建立轻量化MobileNetV3网络作为特征提取网络,进行初步有效特征提取,再设计CSP瓶颈层作为逆瓶颈结构,提高特征提取能力;最后通过CIoU模型建立网络模型的损失函数。在实验室环境下,使用Squid数据集验证轻量化网络模型的有效性,并对其主干网络与损失函数的性能进行分析。通过训练目标数据集,将轻量型网络模型与YOLOV3网络模型结构做消融试验,验证轻量化网络应用在远洋捕捞技术上的准确性以及实用性。结果显示,轻量化网络结构的性能明显优于YOLOV3网络模型结构,可以大幅度降低参数量,提高检测速度,缩短检测时间,提高检测率,提高了鱿鱼实时检测的工作效率。本研究成果为远洋渔业资源调查提供重要依据。