利用RT-PCR检测柑桔碎叶病毒的研究

柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV) 的传统检测方法是指示植物测定,该方法检测周期较长,且需要温、网室等配套设施;酶联免疫吸附方法(ELISA)可用于检测CTLV,但使用的是针对苹果茎沟病毒(ASGV)的抗体,虽然CTLV和AS- GV的亲缘关系已经得到证实,但到目前为止没有对中国的分离株进行实验验证,这在一定程度上影响了结果的可靠性。本研究应用Halistones 等建立的半巢式RT-PCR技术对已感病柑桔品种进行了周年检测,现将研究结果报道如下。     

烟草根黑腐病菌致病力分化及品种抗性差异研究

 烟草根黑腐病由根串珠霉（Thielaviopsis basicola (Berk.et Br.)Ferr.）引起,主要为害烟株的根部,可使根部组织呈特异性黑色坏死而导致烟苗死亡或地上部分生长不良。该病是世界性的烟草病害,在各产烟国家如美国、日本、加拿大等国普遍发生,在我国主要分布于河南、山东、安徽、云南等地     

从感染叶片中提取柑橘衰退病毒总核酸3种方法的比较

用分光光度计检测微量抽提法、 Trizol法和氯化锂法提取的CTV总核酸, 再用RT-PCR和实时RT-PCR法检测, 结果表明: 3种抽提方法均可以获得CTV的总核酸, 其中Trizol法获得的总核酸质量最好, 平均浓度为329.352 1(μg/mL), A260/A280平均值为1.805 2; 进行RT-PCR反应后电泳条带亮度最强; 实时RT-PCR显示其Ct值最小. 氯化锂法与微量抽提法获得的总核酸质量差异不大, 但是微量抽提法更为简便快捷.     

土霉素处理对Valencia夏橙中淀粉及相关基因表达的影响

黄龙病(Huanglongbing,HLB)会造成柑橘韧皮部坏死堵塞,导致光合同化物运输不畅,淀粉大量积累。在感染HLB的4年生Valencia夏橙病株上分别注入0.1和0.2 g·株~(-1)土霉素(Oxytetracycline,OTC),90 d后运用qPCR检测,病株中HLB病原菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,Las)含量均明显降低,且0.2和0.1 g·株~(-1) OTC处理的效果相当。I2/KI显色及LM观测表明,0.2 g·株~(-1) OTC处理后植株的淀粉含量从注射前的18.58μg·mm~(-2)减少至90 d的5.24μg·mm~(-2),而0.1 g·株~(-1)的处理90 d仅降至11.88μg·mm~(-2)。高效液相色谱(HPLC)检测结果表明,注射后90 d内,试验用浓度0.2 g·株~(-1) OTC在植株体内可降解至200μg·kg~(-1)以下。基因表达结果表明,注射0.2 g·株~(-1) OTC后30和90 d,淀粉合成及分解相关基因表达量均下降,其中淀粉合成相关基因AGPase表达量下降最显著,这与OTC注射后30和90 d叶片内淀粉含量下降结果一致。     

土壤处理防治柑橘立枯病的效果及对枳橙的影响

对土壤进行药剂消毒后播种枳橙,以研究杀菌剂处理土壤防治立枯病的效果以及对枳橙的影响。结果表明,40%甲醛、丙森锌、咪鲜胺、噁霉灵、代森锰锌、甲基硫菌灵、硫酸亚铁等7种药剂表现出较好的防病效果。7种杀菌剂处理土壤后,枳橙的发芽率较高,砧木苗的成苗率、成苗数、茎粗、地上部高度及根长均显著优于对照。多菌灵防病效果较差。     

普通烟草铁氧还蛋白Ⅰ的原核表达、抗体制备及在ToMV侵染烟草体内表达分析

【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-Ⅰ)原核表达载体,表达可溶性Fdn-Ⅰ蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-Ⅰ在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-Ⅰ全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-Ⅰ,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-Ⅰ与GST融合表达载体pEGX-Fdn-Ⅰ,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-Ⅰ可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-Ⅰ蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-Ⅰ的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3mmol·L-1条件下表达出大小为41.3kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-Ⅰ的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-Ⅰ在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-Ⅰ大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-Ⅰ的表达。     

四川番茄黄化曲叶病病原分子鉴定及变异分析

 【目的】明确引起四川番茄黄化曲叶病（Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD）的病原。【方法】对采自四川攀枝花市田间表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄植株SC64-67,通过PCR、克隆及测序等技术获得病毒及卫星DNA的全基因组序列,并对序列进行变异分析。【结果】利用双生病毒简并引物PA/PB从4个样品中均扩增得到约500 bp的片段,随机选择SC65进行DNA-A全基因组扩增和序列测定,该DNA分子全长为2 732 nts,系统进化分析表明,其与已报道的中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV）来自云南元谋的菜豆分离物（TYLCCNV-Bean-YM）的核苷酸序列相似性最高,为96.0%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNAβ分子。全序列测定表明SC65 DNAβ全长1 338 nts,与分离自云南楚雄番茄上的TYLCCNV-Y25伴随的卫星DNAβ亲缘关系最近,核苷酸序列相似性为77.5%。【结论】研究表明四川番茄黄化曲叶病样品均受到TYLCCNV/DNAβ病害复合体的侵染,但其病毒DNA-A和卫星DNAβ分子来源于TYLCCNV的不同分离物。     

柑橘黄龙病菌侵染对甜橙叶片糖代谢的影响

【目的】研究甜橙（Citrus sinensis）在柑橘黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）侵染下不同时期糖代谢的变化,以探讨其与柑橘叶片中淀粉积累间的关系,为进一步阐明柑橘黄龙病的发病机理提供理论依据。【方法】以甜橙为供试材料,采用腹接接种病原的方法,试验组植株用感染黄龙病菌的芽条进行嫁接,对照组植株用健康芽条进行接种,每个植株均嫁接3个芽条。在检测到感病的植株中选取生长状况良好且接近的3株作为后续试验材料,每月采集1次成熟叶片,至10月份结束。采集的叶片立即抽提DNA和RNA,并进行可溶性糖及淀粉含量的测定,其余叶片用液氮速冻后保存于-80℃用于测定糖代谢过程中关键酶活性的变化,同时利用实时荧光定量PCR技术比较二者关键酶基因表达量的差异。【结果】随着病原菌胁迫时间的延长,可溶性糖和淀粉含量总体呈升高趋势,均在6月达到峰值,分别为对照的1.59和3.73倍,在感病后期开始有所下降;通过对二者的比值分析发现,感病植株的比值随时间的延长不断下降。在黄龙病菌侵染的不同阶段,各种酶的作用程度有所不同。感病植株的蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性在感病初期迅速上升至顶峰,高达58.44 μg·g^-1·min^-1,至后期已略微低于对照;酸性转化酶（AI）总体显示出较高活性,各个时期均有显著性差异（P＜0.05）,感病中期活性最高为对照的2.91倍;中性转化酶（NI）活性在感病和对照中均维持较低水平,且变化趋势基本一致;可溶性淀粉合成酶（SSs）与束缚性淀粉合成酶（GBSS）协调作用,共同参与淀粉合成的调控;淀粉酶活性在感病不同时期均有所下降,在感病中期低至0.38 U·g^-1。定量PCR分析表明,蔗糖磷酸合成酶基因SPS1表达量显著升高,与其酶活性具有显著相关性（P＜0.05）。蔗糖分解相关基因中,蔗糖合成酶基因SuSy在感病不同时期的表达差异不大,变化幅度小;细胞壁酸性转化酶基因CSCWI在不同时期均上调表达,最高上调约7.4倍,且表达量一直维持在较高水平;与CSCWI相比,液泡酸性转化酶基因CUAI1的表达水平较低。淀粉合成相关酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因最高上调3倍左右;淀粉分解相关基因BAM3、MEX1和DPE2在不同时期有所下调,达到显著性差异水平（P＜0.05）。【结论】柑橘黄龙病感染甜橙后,对植株叶片中光合产物的形成与运转产生影响,扰乱宿主糖代谢平衡,与宿主淀粉积累及后期症状的产生有密切关系。