鸡高迁移率蛋白1双抗体夹心ELISA方法的建立

为建立鸡高迁移率族蛋白1(chHMGB1)蛋白酶联免疫定量分析方法,本研究原核表达重组ch HMGB1蛋白(rchHMGB1)。以纯化的rchHMGB1作为免疫原分别免疫BABL/c小鼠和新西兰大白兔以分别制备针对rchHMGB1的鼠单克隆抗体(MAb)和兔多克隆抗体(PAb),并对兔PAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。以鼠抗rchHMGB1 MAb做为包被抗体,HRP标记兔PAb为检测抗体,建立了定量测定rchHMGB1的双抗体夹心ELISA方法。对该方法进行了特异性、检测限和稳定性等试验。结果显示,包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度均为1∶500稀释,抗原浓度在72.5 ng/mL~75μg/mL范围内呈良好线性关系,相关系数R20.99。该方法可以特异性检测rchHMGB1,最低检测限为36.25 ng/mL,连续6 d检测抗原绘制的标准曲线稳定性良好。本实验建立的rchHMGB1双抗体夹心ELISA方法,灵敏度较高,重复性好,为进一步研究chHMGB1在疾病感染过程中发挥的病理学机制奠定基础。     

犬附红细胞体PCR检测方法的建立

目的 步建立犬附红细胞体PCR检测方法。方法 据已发表的附红细胞体基因序列,设计了一对特异性引物,以犬附红细胞体基因组DNA和附红细胞体可疑病犬样品DNA为模板,聚合酶链式反应（PCR）扩增,扩增产物经克隆测序分析。结果 CR扩增产物大小为541bp,序列分析表明与GenBank数据中发表的序列一致,表明这套引物成功扩增出目的基因序列,但正常犬血样品DNA和弓形虫、伊氏锥虫、吉氏巴贝斯虫、犬细小病毒、犬瘟热的DNA样品都不能扩增出目的基因片段。结论 研究建立的PCR方法可以用于犬附红细胞体的检测,为犬附红细胞体病的诊断及分子流行病学的调查提供了新的手段。     

鸡源性HMGB1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

从鸡胚原代细胞CEF中扩增出鸡HMGB1基因,构建重组原核表达质粒p ET-28a-ch HMGB1,并将p ET-28a-ch HMGB1转入大肠杆菌BL21(DE3)中,于37℃进行诱导表达,经SDS-PAGE分析表明该重组蛋白可以在大肠杆菌中高效表达且以可溶性蛋白的形式存在。蛋白通过Ni-NAT纯化树脂亲和纯化,并作为免疫原制备鼠抗ch HMGB1多克隆抗体血清。该多克隆抗体同时具有ELISA、Western blot和IFA效价,且特异性识别禽源细胞内HMGB1蛋白。     

CpG寡核苷酸对IBDV VP2基因真核表达质粒免疫增效作用

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因表达质粒DNA为免疫原，以CpG的寡核苷酸(CpG-0DN)为免疫佐剂，肌肉注射于14日龄SPF鸡，1周后加强免疫1次，2次免疫后15d和21d分别测定血清ELISA抗体效价，并于免疫后21d用IBDV99儿强毒株攻毒和进行病理学观察。结果显示，(1)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组的ELISA抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组；(2)IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组，且比VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组略高；(3)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组及IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组可明显降低IBDV强毒攻击后引起的急性发病率和死亡率。由此表明，CpG寡核苷酸对IBDV VP2蛋白基因真核表达质粒免疫具有明显增强作用，有很大的应用前景。     

RIG-I样受体信号通路及其调控研究进展

模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)中的RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLRs)是细胞质中一类RNA解旋酶,它们可以通过其RNA配体结合病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),识别非自身的病毒RNA。被感染的细胞中,这种相互作用可以通过触发RLRs以及下游信号分子的活化,最终导致I型干扰素的产生和炎性因子的产生,细胞做出抗病毒免疫应答。本文简单介绍了RLR信号通路的组成及其泛素化调控,总结了病毒逃避RLR通路信号转导的机制,最后阐述了NOD样受体(NOD-like receptors,NLRs)通路对RLR通路的影响。通过对RLR信号通路分子在抗病毒免疫调节中的作用了解,可以为控制病毒的感染和免疫调节提供一个新的思路。     

嗜水气单胞菌溶血素A表达、免疫原性及活性检测

根据已发表的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）溶血素A基因序列设计一对特异性引物,以TPS30菌株基因组为模板,通过PCR扩增溶血素A基因,经T-A克隆、序列测定和分析,结果表明,该基因包含1482 bp碱基,编码494个氨基酸。将溶血素A定向克隆至表达载体pET32a（＋）中,构建重组表达质粒pET-THA,在IPTG诱导下成功获得重组表达蛋白His-GroEL,大小为68 kDa。对该质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达特性分析表明,最佳的诱导表达条件为：在0.1 mmol/L的IPTG浓度下,21℃诱导表达3 h。表达的溶血素A蛋白纯化后免疫小鼠,经Western blot检测,表明该蛋白具有免疫原性。对纯化的溶血素A蛋白复性后,进行溶血实验,结果表明该蛋白具有溶血活性。通过本实验的研究,为进一步研究嗜水气单胞菌溶血素的生物学功能奠定了基础。     

病毒与细胞的互作——自噬

病毒作为一种专性细胞内寄生物,其在感染过程中会与自噬这一维持细胞自稳态的代谢过程发生相互作用,有研究表明自噬在病毒的感染、病毒相关基因的复制转录和致病力方面均起到重要作用,本文对细胞自噬的概念、病毒感染引起细胞自噬、自噬介导的抗病毒作用和病毒利用自噬及其相关途径进行增殖等作一概述。根据细胞自噬功能的两面性,为控制病毒感染和成功研制抗病毒药物奠定基础。     

犬猫感染分枝杆菌的分子流行病学调查

从上海市不同区县采集352份犬猫鼻液、痰液、尿液及宠物饲料样品进行检测,以16s rRNA、IS6110、Rv3878、IS1081、ESAT-6和CFP-10等为目的基因设计引物,结果显示:非健康犬猫样品DNA中,ESAT-6和CFP-10基因检出率分别为43%和38.6%,而致病性分枝杆菌特异的引物Rv3878、IS6110和IS1081基因不能被检出;而在健康犬猫样品DNA中,所有基因的检出率均很低。本研究提示:犬猫可能携带有非结核分枝杆菌,并且患病的犬猫被非结核分枝杆菌污染的几率较健康犬猫更大。     

两种提取细胞外泌体方法的比较

近期研究发现外泌体在很多生理病理过程中起着重要作用,因而外泌体已成为当前的科研热点。本研究从外泌体形态、标志蛋白的表达方面比较了He La细胞外泌体的两种常用提取方法,以期获得更有效地提取Hela细胞中的外泌体方法。利用电镜观察两种方法提取的外泌体形态;动态光散射(dynamic light scattering,DLS)测定外泌体颗粒大小及分布,蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测外泌体标志蛋白CD63、CD81的表达。结果显示,差速离心法与PEG沉淀法所提外泌体都呈茶托样双层膜结构,直径约30~150 nm,无明显形态差异,外泌体标志蛋白正常表达,但PEG沉淀法要引入PEG,有可能影响外泌体生物活性,可见,差速离心法是一种更可靠的有效提取外泌体的方法。     

应用CRISPR/Cas9敲除HeLa细胞DDX21基因对新城疫病毒复制的影响

解旋酶家族是一类对所有生物都至关重要的酶,主要功能是基因解旋,DEAD/H-box家族RNA解旋酶是一类重要的解旋酶。DEAD-box RNA解旋酶DDX21被证实可能调控宿主细胞先天性免疫。新城疫病毒(NDV)是一种对养禽业危害严重的病原,NDV能够通过多种手段调控宿主先天性免疫,为了探讨DDX21如何调控NDV复制,本研究应用CRISPR/Cas9系统建立DDX21基因敲除的HeLa细胞系,并验证其对NDV复制的影响。针对DDX21基因共设计6条sgRNA,构建敲除载体并电转染细胞,通过药物筛选、亚克隆筛选后,以PCR和Western blot进行敲除效率的双重鉴定,并比较野生型和DDX21敲除细胞中NDV的复制效率。结果显示,由于DDX21对细胞生长至关重要,因此仅获得一株DDX21杂合子敲除细胞,Western blot结果显示DDX21表达量被显著抑制,NDV对在敲除细胞上的复制滴度明显低于野生型细胞,说明DDX21发挥正调控NDV复制的作用,本试验为DDX21调控抗病毒先天性免疫研究奠定了基础。