香蕉束顶病毒海口分离物Rb蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗血清制备

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。     

蛋白质相互作用技术在热带植物病毒研究中的应用

蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction)承载着生物体生命活动的各个过程,研究热带植物病毒中的蛋白质-蛋白质相互作用,不仅可以从分子水平揭示病毒蛋白质的功能,还可以揭示病毒在寄主细胞中的侵染机理,从而制定相关策略预防病毒的突然爆发或进行疾病治疗。而蛋白质相互作用研究方法已有50多年的历史,如早期的化学交联法;并且该方法的技术在不断地完善和更新,产生了一序列新的技术,包括酵母双杂交、GST pull-down,免疫共沉淀和串联亲和纯化等多种技术。由于本实验室在热带植物病毒研究中涉及了多种蛋白质相互作用技术,为此,本文总结热带植物病毒研究中常用的蛋白质相互作用技术。     

仙人掌总RNA 提取方法的改进与分析

利用亚硫酸钠分别与TRIzol试剂、RNA plant plus Reagent试剂、BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂、艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂和OMEGA Plant RNA试剂结合的方法,均可获得高质量的仙人掌茎总RNA。反转录成cDNA,RT-PCR结果显示,5种方法提取的总RNA反转录后均能特异性扩增到matK基因。使用TRIzol试剂盒、RNA plant plus Reagent试剂盒和艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取RNA质量相对较高,在cDNA以1∶100稀释时能检测到matK基因;而使用BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒或OMEGA Plant RNA试剂盒时,灵敏度稍低,在cDNA以1∶10稀释时,能检测到目的基因。利用亚硫酸钠结合不同植物总RNA提取试剂盒进行比较研究,为后续制备仙人掌茎高质量cDNA文库及其分子生物学研究奠定基础。     

辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备

为获得高效、灵敏的辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）多克隆抗体,通过差速离心、密度梯度离心等方法首次对辣椒环斑病毒进行了分离纯化,并将获得的高纯度病毒粒子用于免疫新西兰大白兔,制备了该病毒的多克隆抗血清。获得的抗血清经间接法酶联免疫吸附测定（ID-ELISA）,效价高达1 ∶ 125 000,且特异性高,与黄灯笼辣椒中另一种亲缘关系很近的同属病毒辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）不发生血清交叉反应、可有效鉴别这2种Potyvirus病毒。获得的抗血清可用于ChiRSV的检测及后续实验,最适工作浓度在1 ∶ 5 000~1 ∶ 25 000之间。     

酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选

 香蕉束顶病毒DNA2组分编码蛋白的功能尚不清楚,为了揭示其编码蛋白的功能,以本实验室保存的BBTV Haikou4分离物总DNA为模板进行PCR扩增,利用Gateway重组技术将BBTV DNA2 ORF构建到酵母双杂交系统(ProQuest^TM Two-Hybrid System, Invitrogen)的诱饵载体pDEST-32中,并通过酵母表型验证、诱饵质粒毒性验证以及自激活验证。结果显示,转有pDEST32-DNA2 ORF质粒的MaV203酵母菌具有弱的自激活背景,在3-AT 浓度为25 mmol/L的SeC-Leu-Trp-His平板上生长较弱,但在3-AT 浓度为50 mmol/L SeC-Leu-Trp-His 平板上不生长,表明诱饵质粒背景自激活可被浓度为50 mmol/L的3-AT 所抑制。在该条件下共转pDEST32-DNA2 ORF和文库质粒到MaV203感受态细胞进行互作蛋白筛选,通过PCR和测序等手段最终鉴定35个候选蛋白基因,分别编码转录调控因子、生长发育相关蛋白、代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白和未知蛋白等。酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒的构建及其与寄主互作蛋白的筛选,为揭示DNA2组分的蛋白功能提供了科学线索。     

广东烟草花叶病毒移动蛋白基因的cDNA克隆和酶切鉴定

根据已报道的烟草花叶病毒移动蛋白基因序列,设计合成一对特异性引物。以广东ＴＭＶ株系ＲＮＡ为模板,用ＡＭＶ反转录酶反转录合成ｃＤＮＡ第一链;在复性温度５１℃条件下进行ＰＣＲ扩增,获得了一条０．８Ｋｂ的特异扩增产物,与已发表的ＴＭＶＭＰ基因编码区８０３ｂｐ大小相近;并将之克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ（＋）质粒。限制性内切酶酶切分析表明,本研究筛选到的是含ＴＭＶＭＰｃＤＮＡ的正向插入组质粒。     

香蕉条斑病毒及其所致病害研究进展

香蕉条斑病毒病是香蕉的主要病毒病害,可造成7%～90%的产量损失;在某些地区,香蕉条斑病毒病已成为制约香蕉产业发展的主要因素之一。本文较全面地介绍了香蕉条斑病毒的生物学特性、理化特性、病株中的BSV检测方法及病害的防治措施,以期让读者较全面地了解香蕉条斑病毒病,使其在生产上的损失降低到最低水平。     

柑橘黄龙病菌亚洲种菌毛装配蛋白基因(PAP)序列分析、原核表达及抗血清制备

菌毛装配蛋白(Flp pilus assembly protein, PAP)是一种分泌蛋白,参与细菌菌毛的组装,表达量高。本研究以感染柑橘黄龙病的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,用其菌毛装配蛋白基因(PAP)的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段,序列分析表明海南琼海柑橘黄龙病菌PAP基因与柑橘黄龙病菌亚洲种(GenBank登录号:CP001677.5)PAP基因序列一致。功能预测表明它含有两个与分泌功能相关的CpaC和Secretin结构域。PCR产物通过EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切构建重组载体pET32a-PAP。将pET32a-PAP载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni~(2+)-NTA层析柱纯化,并作为抗原腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500～1∶1 000的多克隆抗血清。Western blot分析表明,PAP多克隆抗血清特异性强;以田间样品总蛋白做抗原时,能特异性检测染病样品。本研究为PAP蛋白功能研究和开发柑橘黄龙病菌的蛋白检测产品提供研究基础。     

寄生椰心叶甲绿僵菌的培养特性及ITS序列鉴定

测定了8株分离于自然罹病死亡的椰心叶甲虫体绿僵菌的培养特性并采用其ITS序列进行系统发育分析,结果表明:绿僵菌在以玉米粉作碳源,牛肉膏、蛋白胨作氮源的条件下菌丝的生长速率最快,产孢量最高;绿僵菌对温度和pH的适应范围较广,最适宜的生长温度是26～28℃,pH为6～7时,菌丝生长最快,孢子量最多,绿僵菌的致死温度为55℃.基于8个菌株rDNA的ITS1-5.8S-ITS2区域序列的系统研究结果表明,8个菌株均聚在金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)构成的分支中,明显可分成两群,HY-4、YP-6、SX-2、QH-4为一群,与标准菌株FI1091一AF135214接近,另一群为HK-5、SY-2、SS-2、WC-1,与标准菌株Mb5EF113340接近.     

对虾白斑综合症病毒的分子生物学研究进展

对虾白斑综合症病毒(wkite spot syndrome virus,WSSV)又称对虾白斑杆状病毒(white spot bacilliform virus WSBV),是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。该病毒分子量较大、结构特异,是已知动物病毒中最大的病毒。自1992年以来,各国学者对WSSV进行研究。由于他们研究的方法及研究的侧重点不同,对该病毒命名各异。陈秀男(1993)称之为白斑综合症杆状病毒(WSBV);荷兰Wongteerasupaya(1995)称其为系统外胚层和中胚层杆状病毒(SEMBV);