稻瘟菌糖原合成酶激酶MoGSK3功能探究

【目的】观测稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）糖原合成酶激酶基因MoGSK3敲除突变体表型,明确MoGSK3在稻瘟菌中的潜在生物学功能,为挖掘防治稻瘟菌新型药剂的潜在靶标提供参考。【方法】基于同源重组原理,用split-PCR方法获得稻瘟菌MoGSK3敲除突变体菌株,将MoGSK3基因克隆到pFL2载体上得到MoGSK3-C融合载体,并将其通过PEG介导的原生质体转化法导入MoGSK3突变体中得到回补菌株。培养观察野生型菌株Guy11、突变体菌株G3-9及回补菌株GC-1的菌落形态和生长状况,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测稻瘟菌产孢相关基因的表达量;观察稻瘟菌不同菌株的分生孢子形态,通过附着胞洋葱表皮穿透试验及接种水稻叶片,研究其致病力;通过KI-I-2染色对野生型菌株Guy11及突变体菌株G3-9分生孢子和附着胞中的糖原运输能力进行观测。【结果】稻瘟菌MoGSK3突变体存在多个表型缺陷,与野生型菌株Guy11相比,MoGSK3突变体菌株G3-9菌落直径显著变小,生长缓慢,产孢相关基因表达量下降且分生孢子出现末端伸长畸形的状态。MoGSK3基因缺失还会导致稻瘟菌菌丝末端无法形成正常的分生孢子梗,附着胞无法穿透洋葱表皮形成侵染菌丝,接种划伤水稻叶片也无法形成褐色病斑。对MoGSK3突变体菌株G3-9分生孢子及附着胞进行糖原染色后发现,突变体菌株G3-9在糖原转运能力方面存在明显缺陷。【结论】MoGSK3基因参与稻瘟菌的生长、分生孢子形成及形态建成、侵染、糖原转运等过程,是稻瘟菌重要的毒力因子。     

减量施肥对冬小麦休闲期农田杂草物种多样性及生态化学计量特征的影响

【目的】分析减量施肥对冬小麦休闲期农田杂草物种多样性及生态化学计量特征的影响,旨在为化肥农药“双减”政策产生的生态环境效应科学评价提供参考。【方法】以陕西杨凌曹新庄试验地冬小麦肥料试验为基础,设置不施肥（CK）、减量施肥（氮（N）、磷(P₂O₅)用量分别为165和122 kg/hm²）和常规施肥（N、P₂O₅用量分别为220和160 kg/hm²）3个处理,测定不同处理小麦产量及夏季休闲期农田杂草的生物量、株高、盖度、多度、频度、丰富度,以及藜、狗尾草和马唐的有机碳、全氮、全磷含量,计算植物多样性指标及生态化学计量比（C/N、C/P、N/P）,研究减量施肥对农田杂草物种多样性及生态化学计量特征的影响。【结果】与对照相比,减量施肥和常规施肥处理均对冬小麦休闲期农田杂草的生物量、株高、盖度、多度、频度有明显影响,冬小麦籽粒产量和杂草生物量增加;施肥处理藜和地锦草的株高和生物量均显著增加,其他农田杂草的株高和生物量总体降低。与对照相比,施肥处理苋的有机碳含量以及藜、狗尾草、马唐和葎草的全氮含量均显著增加,藜、马唐全磷含量显著降低。相较于常规施肥,减量施肥处理狗尾草全磷含量显著降低。与对照相比,减量施肥和常规施肥处理藜、狗尾草和马唐氮磷比和碳磷比总体显著增加,碳氮比显著降低。相对于常规施肥处理,减量施肥处理缓解了藜和马唐氮磷比的增加幅度。与对照相比,施肥处理的Shannon-Wiener多样性指数、Simpson多样性指数和Margalef丰富度指数均显著降低;与减量施肥处理相比,常规施肥处理Pielou均匀度指数与丰富度显著降低。植物β多样性指数表明,常规施肥对小区植物多样性的影响最大。【结论】减量施肥和常规施肥处理冬小麦休闲期农田杂草的物种多样性均明显降低,但减量施肥处理缓解了常规施肥对农田杂草生物多样性和生态化学计量特征的影响。     

毛竹入侵对落叶阔叶林土壤理化性质和胞外酶活性的影响

【目的】研究毛竹（Phyllostachys edulis）入侵亚热带北缘落叶阔叶林对土壤理化性质和土壤胞外酶活性的影响,为探究毛竹入侵条件下森林生态系统养分循环过程与固碳潜力及森林的毛竹入侵治理提供科学依据。【方法】在毛竹入侵样带上,选择落叶阔叶林（麻栎林Quercus acutissima）、竹阔混交林（混交林）和毛竹林3种林分为研究对象,采集其林下地表0~10 cm土壤,进行土壤理化性质和土壤酶活性的测定,包括土壤pH、含水率和有机碳、全氮、NH⁺₄-N、NO^-₃-N、全磷、有效磷含量,以及β-葡糖苷酶（BG）、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）、酸性磷酸酶（AcP）、酚氧化物酶（POX）、过氧化物酶（PER）活性和酶计量(V_C/N、V_N/P、V_C/P),比较不同林分的土壤指标。【结果】①随着毛竹入侵,毛竹林土壤pH值和含水率显著增大,且与混交林、麻栎林差异显著（P<0.05）;其土壤有机碳、NO^-₃-N和全氮含量显著下降（P<0.05）,NH⁺₄-N、有效磷和全磷含量与混交林、麻栎林差异不显著。②土壤碳、氮和磷循环相关的水解酶（BG、NAG+LAP、AcP）活性均随毛竹入侵呈下降趋势,氧化酶（POX、PER）活性变化趋势与之相反;酶计量分析表明,毛竹林土壤的V_N/P显著低于混交林和麻栎林（P＜0.05）,而V_C/N、V_C/P在不同林分间差异不显著。③酶活性的矢量分析表明,毛竹林土壤微生物的磷限制程度高于混交林和麻栎林。④土壤水解酶活性与土壤有机碳、NO^-₃-N、全氮、有效磷含量或pH有显著相关关系,氧化酶活性与土壤性质相关性总体不显著。【结论】毛竹林取代落叶阔叶林（麻栎林）后,土壤有机碳和养分含量及相关水解酶活性降低,不利于原有落叶阔叶林土壤碳库与养分库的保存。     

4个品种猕猴桃发酵酒品质评价

【目的】研究猕猴桃品种对猕猴桃果酒品质的影响,探索理化指标与感官评价的相关性,为通过原料筛选生产优质猕猴桃酒提供依据。【方法】以生理成熟期的金艳、翠香、翠玉和东红4个品种猕猴桃为原料,经过后熟软化、带皮破碎、添加果胶酶及ADT活性干酵母发酵等工序,酿制4个品种猕猴桃发酵酒,测定4种猕猴桃原料的理化指标（可溶性固形物（TSS）、总酸（TA）、固/酸比、pH值等）,分析4种发酵酒在理化参数（TSS、TA、酒精度、残糖、挥发酸、可溶性蛋白）、抗氧化物质（总酚、维生素C、黄酮）、香气物质（酯类、醇类、萜烯类等）和感官品质（外观、香气、口感、风格）等方面的差异,研究不同品种猕猴桃果酒间感官指标与理化指标的关系。【结果】4个品种猕猴桃酿酒原料的TSS、TA和pH,以及4种果酒的TSS、TA、酒精度、可溶性蛋白及总酚、Vc、黄酮等均表现出不同程度的差异,发酵酒的酒精度与后熟果实原料的pH值之间存在极显著负相关。在4种猕猴桃果酒中,共检测出7类83种挥发性化合物,其中共有类型6类,共有物质24种,以酯类化合物的种类最多、相对含量最大。4种猕猴桃酒香气成分总质量浓度由大到小分别为金艳（3 907.28 μg/L）＞东红（3 493.22 μg/L）＞翠玉（3 176.01 μg/L）＞翠香（2 768.17 μg/L）。4种猕猴桃酒的感官评分中,外观和总分存在一定差异,总分由高到低依次为东红＞金艳＞翠香＞翠玉。感官指标与理化指标的相关性分析表明,不同品种猕猴桃果酒的外观与其可溶性蛋白质量浓度呈显著负相关,香气与芳樟醇和萜烯类物质质量浓度呈显著正相关,口感与原料果实的固/酸比呈显著正相关,而与黄酮质量浓度呈显著负相关。【结论】4个猕猴桃品种中,东红猕猴桃果酒的外观、香气、口感及与感官测试相关的理化指标表现最优,最适于酿制猕猴桃酒。     

微囊藻毒素-LR对生菜非结构性碳水化合物代谢的影响

【目的】研究低质量浓度微囊藻毒素-LR（MC-LR）慢性暴露对生菜（Lactuca sativa）叶片及根系非结构性碳水化合物代谢的影响,为富营养化水体在生菜灌溉中的应用提供理论指导。【方法】以散叶生菜为试验材料,采用土培试验方法,设置不同质量浓度（0（对照组）,1,5,10,30 μg/L）MC-LR的水溶液灌溉生菜30 d,通过分析生菜叶片及根系中可溶性糖（葡萄糖、果糖和蔗糖）及淀粉含量、蔗糖和淀粉代谢相关酶活性的变化,探讨生菜非结构性碳水化合物代谢对MC-LR慢性暴露的响应。【结果】10和30 μg/L MC-LR组生菜对MC-LR的富集系数较5 μg/L MC-LR组分别显著上升10.85%和17.83%（P＜0.05）,而对MC-LR的转运系数分别显著下降17.46%和13.85%（P＜0.05）。与对照组相比,1 μg/L MC-LR组生菜净光合速率显著提高了9.17%（P＜0.05）,叶片中果糖含量及根系中葡萄糖含量和淀粉酶（AMS）活性分别显著增加了52.71%,19.13%和37.01%（P＜0.05）;5,10和30 μg/L MC-LR组生菜净光合速率提高,但差异不显著（P＞0.05）,叶片和根系中葡萄糖、果糖和蔗糖含量均显著增加（P＜0.05）,叶片中性转化酶（NI）活性分别显著降低了27.10%,38.01%和37.29%（P＜0.05）,淀粉合成酶活性分别显著增加20.92%,24.57%和30.28%（P＜0.05）,根系蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和AMS活性均显著增加（P＜0.05）。【结论】1 μg/L MC-LR水溶液灌溉对生菜叶片和根系中非结构性碳水化合物的分布和代谢影响较弱;而5～30 μg/L MC-LR水溶液灌溉通过促进生菜根系淀粉分解和蔗糖代谢活性,维持体内较高浓度的可溶性糖,从而提高生菜的抗逆性。     

洋葱AcSCL4的克隆及其功能分析

【目的】初步探讨AcSCL4在洋葱成花中的功能,为解析洋葱成花分子调控机制提供理论基础。【方法】以长日生态型洋葱品系SB2为试验材料,根据已有的洋葱转录组数据,通过qRT-PCR筛选目的基因AcSCL4后进行基因克隆,并对其进行生物信息学分析;构建AcSCL4基因的过表达载体pB221-3300-AcSCL4并转化农杆菌,采用花序浸染法浸染拟南芥,并对T₃代纯系转基因植株进行表型分析和开花相关基因表达量分析。【结果】洋葱AcSCL4基因CDS长1 515 bp,编码504个氨基酸;AcSCL4蛋白N端高度变异,C端有GRAS结构域。聚类分析发现,AcSCL4与石刁柏和棉花的SCL4蛋白亲缘关系较近。与野生型拟南芥相比,AcSCL4过表达植株表现晚花表型。荧光定量PCR结果表明,与野生型拟南芥相比,AcSCL4过表达植株开花调控基因CO和FT的表达量极显著下降。【结论】AcSCL4通过调控CO及FT基因表达来抑制洋葱开花。     

牦牛MYL3基因的克隆及组织表达分析

【目的】研究牦牛MYL3基因的结构和表达特征,探究其生物学功能及影响牦牛肌肉生长发育的机制。【方法】以美仁牦牛cDNA为模板,PCR扩增MYL3基因编码区序列(CDS),利用MEGA11软件构建系统进化树,利用生物信息学软件对其编码蛋白进行分析。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MYL3基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏（参照）、睾丸、肌肉和脂肪组织中的相对表达量。【结果】牦牛MYL3基因CDS区长600 bp,共编码199个氨基酸,存在1个碱基突变位点,位于第165位(A>T)。系统进化分析结果显示,牦牛与普通牛的亲缘关系最近,与单峰驼的亲缘关系最远。生物信息学分析结果显示,牦牛MYL3蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽,不存在跨膜结构,主要存在于细胞质内,有8个磷酸化位点和2个N 糖基化位点,蛋白的二级结构以α-螺旋为主,主要与调控肌肉生长发育的相关蛋白相互作用。RT-qPCR结果表明,MYL3基因在心脏中的表达量最高,极显著高于其他组织;肌肉中次之,与除心脏外的其他组织存在极显著差异。【结论】MYL3基因可能与牦牛心脏发育有关,对肌肉的生长发育和肉质有一定影响。     

3株蒜头果内生木霉的鉴定及其对幼苗的促生作用研究

【目的】鉴定3株蒜头果内生木霉,并探讨其对幼苗生长发育的影响,为蒜头果内生木霉资源的利用及优质苗木培育提供参考。【方法】采用分子系统学和形态学方法,鉴定3株分离自蒜头果茎部和根部的内生木霉。通过接种效应试验,测定根施3种木霉菌液和无菌水（对照）后,蒜头果幼苗的生长性状、生物量、叶绿素含量、抗氧化酶活性、可溶性糖和可溶性蛋白含量以及木霉的根系定殖率,并结合各项指标的隶属函数值对不同处理的蒜头果幼苗品质进行综合评价。【结果】通过构建木霉属菌种系统发育树以及对菌落形态和微观结构的观察,确定3株内生木霉分别为哈茨木霉（Trichoderma harzianum,SF15）、贵州木霉（T. guizhouense,SF548）和绒毛木霉（T. tomentosum,SF434）。接种菌株SF15和SF548的蒜头果幼苗株高增量、叶片增量显著高于对照,3种木霉处理的幼苗茎粗增量均显著高于对照。接种菌株SF15和SF548的蒜头果幼苗主根长和根部吸器数量显著高于对照,而最大吸器直径显著低于对照,且不同处理组的蒜头果幼苗主根长与根部吸器数量呈一定正相关,而与最大吸器直径呈一定负相关。接种菌株SF15和SF548的幼苗地下、地上、全株鲜质量及干质量均显著高于对照,接种菌株SF434的处理组全株鲜质量及地下和全株干质量显著高于对照。3个接菌组蒜头果幼苗叶片叶绿素含量,POD、SOD、CAT活性以及可溶性糖和可溶性蛋白含量均显著高于对照。接种菌株SF15和SF548的蒜头果幼苗根系定殖率分别为64.25%和61.78%,显著高于接种SF434的根系定殖率55.57%。基于各项测定指标的隶属函数值,不同处理组幼苗品质的综合排名为：接种SF15的处理>接种SF548的处理>接种SF434的处理>对照。【结论】3株蒜头果内生木霉对幼苗生长、生物量、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及可溶性糖、可溶性蛋白含量的提高有积极促进作用,其中菌株SF15和SF548的促生效果较为显著,为蒜头果潜在的促生菌株。     

禽腺病毒流行株FAdV-4-AH-F41的分子特征及对细胞因子的诱导作用

【目的】分析1株血清4型禽腺病毒（FAdV-4）流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水 肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞（LMH）对病原进行分离,采用PCR、透射电镜（TEM）观察和间接免疫荧光试验（IFA）对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体（SPF）鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸（cGAS）、干扰素刺激因子（STING）、白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8、干扰素-α（IFN-α）、IFN-β、干扰素调节因子7（IRF7）、线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）、主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70~90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列（43 708 bp）;遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30 453-30 674 bp,第2个发生在36 884-36 988 bp,第3个发生在43 401-43 715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照（DMEM/F12处理）相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中cGAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ β差异达极显著水平（P<0.01）,IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平（P<0.05）,STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。     

福建柏愈伤组织诱导与抗褐化研究

【目的】比较不同抗褐化剂减轻福建柏组织培养过程中褐化现象的效果,以提高福建柏愈伤组织培养的增殖分化能力。【方法】以福建柏鳞叶和茎段为外植体,通过单因素试验,研究0.0～2.5 mg/L NAA和2,4 D及0.0～3.0 mg/L IBA对愈伤组织诱导率与生长状态的影响;以福建柏茎段为外植体,采用单因素和多因素组合试验,研究100～2 000 mg/L聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、100～1 000 mg/L活性炭（AC）和V_C以及不同质量浓度VC与AC组合,对愈伤组织污染率、死亡或褐化率及诱导率的影响;以诱导的愈伤组织为材料,采用单因素试验,研究100～1 000 mg/L PVPP、100～300 mg/L V_C、200～1 000 mg/L AC、30～100 mg/L V_B对愈伤组织增殖生长量、增殖率、褐化率及PPO、POD活性的影响。【结果】① 不同质量浓度NAA、2,4-D和IBA对福建柏鳞叶愈伤组织的诱导率总体高于茎段,各生长素对福建柏鳞叶和茎段愈伤组织的诱导率均表现为NAA＞IBA＞2,4-D,所有处理中以1.0 mg/L NAA对福建柏鳞叶愈伤组织的诱导率最高,为83.33%;以0.5 mg/L NAA对茎段愈伤组织的诱导率最高,为61.11%;愈伤组织生长状态和抗褐化效果优劣依次为NAA、2,4-D、IBA。②仅100 mg/L V_C+200 mg/L AC处理的愈伤组织污染率低于不添加抗褐化剂的对照;死亡或褐化率仅500 mg/L PVPP处理与对照相同,均为0.00%,其余处理均高于对照;诱导率则以不同质量浓度PVPP、1 000 mg/L VC、100 mg/L V_C＋200 mg/L AC处理与对照相当或高于对照,其余处理均低于对照;愈伤组织生长状态总体以PVPP处理表现最优。③仅300 mg/L PVPP、200和400 mg/L AC处理的愈伤组织增殖率高于对照,增殖生长量仅100和200 mg/L PVPP、100 mg/L V_C、200 mg/L AC处理高于对照;所有处理中以200 mg/L AC处理的愈伤组织增殖率和增殖生长量最高,分别为70.00%和10.07 g;各抗褐化剂对福建柏愈伤组织增殖效果的优劣依次为PVPP、AC、V_C、V_B。④不同抗褐化剂处理的愈伤组织褐变率均呈先增加后趋于稳定的变化趋势,但变化幅度存在显著差异;各抗褐化剂的抗褐化效果优劣依次为AC、PVPP、V_C、V_B。⑤不同质量浓度PVPP、V_C、AC处理对福建柏愈伤组织PPO和POD活性的影响具有显著差异,但各处理PPO活性均与对照无显著差异,POD活性以500 mg/L AC处理显著高于其他处理。【结论】在福建柏愈伤组织诱导阶段,愈伤组织的褐化与生长素种类有关,生长素NAA、2,4-D适用于福建柏愈伤组织的诱导,IBA诱导的愈伤组织容易褐化,添加适量抗褐化剂能减少愈伤组织的褐化情况。在愈伤组织增殖培养阶段,适宜质量浓度的PVPP、AC作为抗褐化剂能有效减缓福建柏愈伤组织的褐化进程,保持愈伤组织的正常增殖生长,但高质量浓度的抗褐化剂会抑制愈伤组织的生长。