紫花苜蓿盐诱导类受体蛋白激酶基因MsSIK1的克隆及功能分析

【目的】对紫花苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhongmu-1）stress-induced protein kinase gene 1（MsSIK1）进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得MsSIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）模拟该基因的蛋白结构。构建MsSIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsSIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位荧光信号。通过Real time-PCR分析MsSIK1在NaCl、ABA和干旱处理条件下的表达特征。利用农杆菌侵染方法获得转基因拟南芥植株,通过RT-PCR对转基因植株进行表达鉴定,获得转基因植株后,利用转基因株系进行盐处理进而对成苗期转基因拟南芥性状鉴定。在盐胁迫处理下,测定野生型与转基因株系的叶绿素含量、MDA含量进而验证该基因的抗盐功能。【结果】获得MsSIK1编码序列2 478 bp,编码825个氨基酸。该蛋白C端与多种植物激酶具有相当高的同源性,模拟蛋白结构发现该基因具有类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域、跨膜结构域和富含亮氨酸重复序列的膜外结构域。Real time-PCR分析表明该基因在NaCl、ABA和干旱处理条件下上调表达,其中在盐处理条件下,MsSIK1表达先升高后降低,在处理4 h时达到最大值（约为对照值的7倍）。在干旱胁迫处理时,MsSIK1受诱导表达增强明显,当处理2 h时表达量达到最大值（约为对照值的6倍）;ABA处理时,MsSIK1被诱导表达明显,当处理3 h时表达量达到最大值,约为对照值的6.8倍。MsSIK1与GFP融合瞬时表达的洋葱表皮细胞中的荧光信号主要集中于质膜附近,转化空载体的洋葱表皮细胞中的荧光信号分布于细胞各个部位。转基因植株的RT-PCR鉴定表明,T₁代6个株系中所得到的MsSIK1条带明显、亮度高,且T₁-10中表达量最高;但在野生型中检测不到该条带,说明外源基因已经整合到拟南芥染色体中并能遗传到子代。成苗期转基因拟南芥盐处理后发现T₃-2、T₃-6、T₃-10转基因株系较野生型植株长势好,说明MsSIK1的转入提高了拟南芥的抗盐性。与对照相比,转MsSIK1拟南芥在NaCl处理下,叶绿素含量下降较少,其中,野生型叶绿素含量降低了77%,T₃-3降低了53%,T₃-6降低了44%,T₃-10降低了35%;同样盐胁迫下,3个转基因株系的MDA含量积累较少,其中,野生型MDA的含量是T₃-10株系的1.3倍。【结论】MsSIK1作为一个类受体蛋白激酶受多种逆境胁迫诱导,该基因的过量表达提高了拟南芥的抗盐性。     

Tg29诱导糯玉米单倍体的效率及DH系鉴定

【目的】检验新选诱导系Tg29诱导糯玉米单倍体的效率以及糯玉米DH系的稳定性,为单倍体技术在糯玉米育种上的应用提供参考。【方法】将玉米孤雌生殖诱导系Tg29与16份不同基因型的自交系和杂交种杂交,并根据籽粒Navajo斑纹和ABPI紫色植株显性双标记系统对所诱导的孤雌生殖单倍体进行筛选;分析从京糯6/Tyc115中诱导出的单倍体经秋水仙素加倍获得的16份DH系的田间和农艺性状表现,从而对糯玉米DH系进行鉴定。【结果】在16份糯玉米母本材料中,从JN18、JN18/BN2和Tyc115中诱导单倍体的频率较高,分别为10.41%,9.79%和9.25%;而从浚白34和京糯6中诱导单倍体的频率较低,分别为3.45%和3.13%;Tg29的平均单倍体诱导率为6.55%。在株高、穗位、株型性状上,糯玉米DH系内均呈高度的一致性,其中Tyc115、京糯6、JN18等DH系在生长势和果穗性状上符合育种要求。【结论】利用Navajo斑纹和ABPI紫色植株显性双标记系统来鉴别杂交诱导的糯玉米单倍体是可靠的;Tg29对不同糯玉米基因型材料均能诱导产生单倍体,但诱导率与母本基因型材料有很大关系;糯玉米单倍体加倍获得的DH系的群体遗传结构是同质的,是完全意义上的纯合。     

黑枸杞花青素研究进展

目的研究青藏高原黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7的凋亡作用及相关分子机制。方法利用扫描电镜、DAPI和Hoechst染色、流式细胞术、RT-qPCR和Western-blot检测不同质量浓度黑枸杞花青素诱导小鼠巨噬细胞24 h后对细胞形态学、细胞凋亡率、JNK信号通路因子及相关因子mRNA和蛋白表达的影响。结果花青素诱导细胞24 h后未见明显凋亡形态,且细胞数量增多,细胞凋亡率极显著下降(P<0.01);随着黑枸杞花青素质量浓度增加,Caspase-3 mRNA及蛋白表达降低,Bax/Bcl-2 mRNA表达量比值降低,JNK通路因子JNK mRNA及p-JNK蛋白表达降低且呈剂量依赖性;JNK抑制剂组能显著降低JNK通路因子JNK mRNA (P<0.05)及p-JNK蛋白表达(P<0.01);与JNK抑制剂组相比,花青素+SP600125组能显著降低JNK通路因子JNK mRNA (P<0.05)及p-JNK蛋白表达(P<0.01)。结论黑枸杞花青素可能通过JNK通路抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡从而发挥免疫调节作用。     

新疆西昆仑地区泥石流灾害分析与评价

[目的]评价研究区泥石流的危险性,找出适合新疆西昆仑地区泥石流灾害研究的技术和方法。[方法]以新疆西昆仑山脉西段马尔洋地区为研究对象,在充分收集、研究前人资料和有效利用其他信息源的基础上,通过对研究区ETM+影像数据的研究,对研究区泥石流灾害点进行了判读。结合DEM数据,对该区地形地貌进行了研究。[结果]选取了合适的泥石流灾害危险性评价指标体系。一般危险区、中度危险区、高度危险区、极度危险区,面积分别为:31.69,40.70,38.31,25.83km2,所占比例分别为:23.21%,29.81%,28.06%,19.92%。[结论]研究区泥石流灾害极度危险区和高度危险区占总面积的47.98%,主要分布在研究区的中部和西北部区域,为泥石流灾害高度危险性易发区。     

罗汉果葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

 从罗汉果（Siraitia grosvenorii）转录组中获得一条与罗汉果甜苷Ⅴ生物合成相关的葡萄糖基转移酶（UDPG）的unigene片段,以罗汉果授粉后70 d的果实RNA为模板,利用RACE和RT-PCR技术克隆UDPG全长基因,将克隆得到的SgUDPG1基因连接到原核表达载体pEASY-E1上,构建融合表达载体,转化到大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达,重组蛋白纯化,SDS-PAGE检测表达产物以及Western-blotting和质谱鉴定蛋白产物。结果表明,获得了1条SgUDPG1,全长为1 959 bp,开放阅读框ORF为1 365 bp,编码1条454 aa的肽链,理论分子量为51.2 kD,等电点为5.39,具有植物中次生代谢产物糖基转移酶特有的保守结构域PSPG-box motif。SgUDPG1在授粉后50 d和70 d的果实中表达逐渐升高,是对照授粉后3 d的5.16倍和13.12倍,与果实中甜苷Ⅴ含量呈相同趋势。此基因的ORF可以在大肠杆菌中表达,并且可以纯化出比理论分子量大5.3 kD的融合蛋白,通过Western-blotting和质谱鉴定,确定该蛋白属于罗汉果葡萄糖基转移酶。     

河西走廊制种玉米生育中后期叶部真菌病害诊断与病原初步鉴定

对河西走廊制种玉米生育中后期叶部真菌病害进行田间调查,并将采集到的标本进行组织分离、病原鉴定和致病性测定。结果表明,引起制种玉米生育中后期叶部真菌病害的植物病原有13种,其中由Curvulairia lunata(Wakke)Boed病原引起的玉米弯孢菌叶斑病是玉米叶部的一种新病害,在田间发病率较高,病情指数较大,危害十分严重;由Exserohilum turcicum(Pass.)Leonard et Suggs和Bipolaris maydis(Nishik.et Miyabe)Shoemaker病原引起的大斑病和小斑病是玉米生育中后期叶部发生的主要真菌病害;Physoderma maydis Miyabe和Fusarium subglutinans(Wollenwe.et Reinking)P.E.Nelson et al病原引起的褐斑病和顶腐病有加重发生的趋势;Puccinia sorghi Schw引起的普通锈病在局部区域的一些品种和组合上发病较为严重;其他叶部病害零星发生,对制种玉米正常的生长发育影响较小,一般不会造成流行为害。     

Genetic Diversity Analysis of Microsatellite DNA Markers in Swamp Buffalo

This study was aimed to investigate the genetic diversity of swamp buffalo breeds in China.The analysis of genetic diversity was performed in 40 buffalo individuals from 8 buffalo breeds（Dechang buffalo,Dehong buffalo,Wenzhou buffalo,Guizhou buffalo,Xilin buffalo,Fuzhong buffalo,Murrah buffalo and Nili-Ravi buffalo）by 30 microsatellite loci and LabChip chip test method.The results showed that 332 alleles at 30 microsatellite loci were found in 8 buffalo breeds,the average values of gene diversity and PIC were 0.7808 and 0.7554,respectively.Cluster analysis indicated that Dechang buffalo and Dehong buffalo firstly clustered together,followed by Fuzhong buffalo,Guizhou buffalo,Wenzhou buffalo and Xilin buffalo.Moreover,Murrah buffalo and Nili-Ravi buffalo clustered together.Our findings revealed that the 30 microsatellite loci could be used as an effective genetic marker for the analysis of genetic diversity among the buffalo breeds,which enriched the current SSR marker resources in buffalo.     

鸡PD-1单克隆抗体的制备及生物学功能研究

试验旨在筛选并制备鸡PD-1单克隆抗体,对该单克隆抗体的免疫学特性、结合活性及其对鸡PD-1/PD-L1信号通路激活的阻断作用进行初步研究。运用杂交瘤细胞融合技术筛选杂交瘤细胞株,采用ELISA方法、Ig抗体亚型鉴定试剂盒、Western blotting鉴定抗体的免疫学特性,利用间接免疫荧光技术及流式细胞术检测筛选单抗与鸡PBMCs的结合情况,应用该单抗与IBDV感染7 d后的鸡PBMC细胞作用,利用实时荧光定量PCR技术检测IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子的表达情况。结果显示,试验获得1株特异、稳定分泌鸡PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为PD-1-D05。该单克隆抗体的亚型属于IgG1,杂交瘤细胞培养上清和腹水的效价分别为1：2¹¹和1：2.048×10⁵。ELISA和Western blotting检测结果表明,PD-1-D05单抗能与免疫原发生特异性反应,与pET-28a （+）、Rosetta菌株蛋白提取液上清及无关蛋白无交叉反应。间接免疫荧光及流式细胞术检测结果显示,PD-1-D05单克隆抗体能与鸡PBMC特异性结合,且IBDV感染7 d后的PBMC经单抗处理后,IL-2表达量显著升高（P<0.05）,IFN-γ转录水平显著下降（P<0.05）,IL-6表达水平较IBDV攻毒组细胞虽有所下降,但并无统计学差异（P>0.05）。结果表明,试验成功筛选并制备了能够稳定分泌鸡PD-1单克隆抗体的细胞株,所获得的PD-1单克隆抗体具有良好的免疫学特性,该单抗能够特异性识别鸡PD-1分子并与鸡PBMC细胞特异结合,并在一定程度上恢复由于IBDV感染导致的PD-1/PD-L1信号通路激活引发的免疫调节相关细胞因子IL-2、IFN-γ的异常表达。     

水安全与河流道德伦理观的思考

从水安全含义出发,对陕西省水的情势和水安全问题进行了讨论。论述了河流道德伦理观,并以渭河为例说明了维护渭河健康生命需采取的措施,主要包括加强水资源统一管理、退耕还林(草)、降低潼关高程、减少渭河洪水灾害、加强渭河水环境治理、减少污水排放量、节约用水、保证生态用水、以外流域调水弥补资源性缺水、注重城乡发展、实行计划生育等。     

根河林业局森林生态服务功能价值评估

利用内蒙古大兴安岭森林生态站的长期定位观测和根河林业局2012年森林资源统计数据,参照林业行业标准《森林生态系统服务功能评估规范》(LY/T1271-2008),首次采用分布式评估与旅行成本相结合的方法,对根河林业局森林生态服务功能进行价值评估。结果表明:1)根河林业局森林服务功能价值为317亿元·a^-1,各功能对总价值量的贡献率依次为固碳释氧>涵养水源>保育土壤>净化大气环境>物种保育>营养物质积累>森林游憩。2)固碳释氧和涵养水源功能是根河林业局森林的主要功能,占服务功能总价值量的63.7%。森林年固碳量可抵消内蒙古自治区碳排放量（6 987.07万t,2008年）的7.8%;年涵养水源量对根河年径流量(20.6亿m³)的贡献率为32.8%,是海拉尔河年径流量(32亿m³)的21.1%。3)针叶林单位面积服务功能价值量大于阔叶林,不同树种六大功能单位面积的价值量依次为樟子松(Pinus sylvestris)>兴安落叶松(Larix gmelinii)>白桦(Betula platyphylla)>山杨(Populus davidiana)。4)单位面积服务功能价值量随林分年龄增大而增大,不同龄组六大功能单位面积的价值量为过熟林>成熟林>近熟林>中龄林>幼龄林。