H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。     

化橘红花、果中挥发油成分的比较

目的 比较化橘红花、果中挥发油成分差异.方法 采用低温变压浸出法提取化橘红花、果中挥发油,再用精馏法分离、气相色谱-质谱联用技术分析挥发油中轻、重组分.结果 化橘红花、果中轻组分挥发油成分包括萜类、醇类、酯类、脂肪酸和芳香烃类,均以脂肪酸、萜类为主;重组分挥发油成分包括甾醇类、香豆素类、脂肪酸类、萜类和烷烃类,均以甾醇...     

基于多元线性回归的开发井绝对无阻流量预测

对于新钻开发井,气井绝对无阻流量的大小是决定新钻井能否实施的关键指标,所以准确、快捷地预测气井绝对无阻流量对于气藏储量动用、提高采收率具有重要意义.目前绝对无阻流量是通过气井投产后采用稳定试井获得,对于未钻的井现场多数采用类比法,但精度低,影响钻井决策.针对绝对无阻流量预测的问题,首先开展了绝对无阻流量影响因素的渗流理论分析以及与实际生产动态特征的相关性分析,以此为基础,利用多元线性回归方法开展了绝对无阻流量与各地质参数的定量关系研究,建立了新钻开发井绝对无阻流量与不同参数的预测模型,并对不同模型进行了统计学检验以及实例检验.结果表明,影响绝对无阻流量的主要因素主要有地层系数(kh)、地层压力(pe)、孔隙度(φ)、动态储量等,各因变量之间不存在共线性,建立的4种模型中以kh、pe两个参数建立的预测模型在对新钻开发井的实际预测中精度较高,预测模型中需要的参数kh、pe在现场生产中也容易获得,计算方法简单快捷,解决了新钻开发井快速预测问题,为新钻开发井是否实施提供了依据,因此,该方法对气藏打开发井、特别是低渗透气藏后期补打开发井的决策中具有一定的实践意义.     

永州地区早春大棚甜瓜新品种引进比较试验

为筛选出适宜永州地区早春大棚种植的甜瓜新品种,通过随机区组设计,对6个参试甜瓜品种进行比较。试验结果表明,脆禧表现为早熟,一品红、玉菇生育期与CK(雪峰蜜2号)接近,3个品种均表现高产,且商品性、口感、含糖量较优,因此认为脆禧、一品红、玉菇这3个品种适宜在湖南永州地区推广种植。     

三氟化硼催化合成2,3,4,4'-四羟基二苯甲酮新方法研究

以高沸程石油醚代替1,1,2,2-四氯乙烷为溶剂,对焦性没食子酸合成2,3,4,4'-四羟基二苯甲酮的经典方法——三氟化硼催化法进行改进。在常温下快速搅拌和加热,使原料和溶剂体系由混悬液转变成棕色油状溶液,一定时间后瞬间产生大量黄色油性结晶产物沉淀,完成合成反应。采用正交试验法优化反应条件为:焦性没食子酸0.05 mol、对羟基苯甲酸用量0.055 mol、催化剂用量0.16 mol(20 mL)、反应温度110℃、反应时间1 h,在此条件下,2,3,4,4'-四羟基二苯甲酮产率达83.24%,产品纯度为97.83%。该方法与传统方法的产率相近,生产过程中比1,1,2,2-四氯乙烷的毒性小、成本低,改进的合成反应还具有时间短、后处理简便、催化剂可回收等优点。对提纯到99.53%的产物,通过红外吸收光谱、核磁共振谱、质谱等方法进行鉴定和表征,确定了产物为2,3,4,4'-四羟基二苯甲酮。     

α-银环蛇毒素融合基因表达载体的构建及原核表达

设计并人工合成2条引物,对作者构建的重组质粒pMD-α-BGT进行PCR扩增获得α-BGT基因。将目的基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT。克隆质粒经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,成功构建融合基因表达载体pGEX-α-BGT,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。表达产物经15%SDS-PAGE分析,在约34ku处可见明显的外源蛋白质表达带,与预计的分子量大小一致,其表达量约占细菌总蛋白的32.6%。Westernblotting和间接ELISA检测结果表明,α-BGT的融合表达蛋白与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。     

新疆冬季密闭羊舍的空气质量分析

对一栋密闭式羊舍内的空气质量进行了观测及分析,结果表明:在舍内0.6m、1.6m和3.0m的不同高度层中,氨气的平均浓度分别35.0mg/m3、36.7mg/m3和44.2 mg/m3,其中3.0m显著高于0.6m、1.6m(P<0.05),0.6m、1.6m之间差异不显著(P>0.05);硫化氢的平均浓度分别为0.0039mg/m30、.0027 mg/m3和0.0030mg/m3,各层浓度间差异均不显著(P>0.05);二氧化碳的平均浓度分别为2571mg/m3、2593mg/m3和2581mg/m3,各层浓度间差异均不显著(P>0.05)。舍内NH3、H2S、CO2气体呈现一定的昼夜变化,三种气体白天的平均浓度均低于夜间。而舍内各环境因素之间存在一定的相关关系,其中温度高低对舍内NH3与CO2气体的含量有明显的影响,舍内空气湿度的变化对TSP、PM10的含量和粪便含水量对舍内NH3的含量亦有明显的影响,它们之间均存在显著的相关性。     

饲粮蛋白质水平对空怀期云南半细毛羊氮沉积和养分排放的影响

本试验旨在研究饲粮蛋白质水平对空怀期云南半细毛羊氮沉积和养分排放的影响,以期为空怀期云南半细毛羊饲粮配比和减少环境负荷研究提供理论参考。试验选用50只体况良好、体重相近、38月龄的空怀期云南半细毛羊,随机分成5个组(每组10只),分别饲喂蛋白质水平为7.60%(组1)、9.49%(组2)、11.29%(组3)、11.56%(组4)和14.96%(组5)的饲粮,饲粮其他营养水平保持一致。试验羊进行19d的饲养试验,其中预试期14d,正试期5d。正试期从每组选择5只试验羊进行消化代谢试验,试验羊在代谢笼中单笼饲养,采用全收粪尿法连续收集5d粪便,并采集饲粮样品。结果表明:1)饲粮蛋白质水平对空怀期云南半细毛羊的干物质采食量和粪干物质排放量无显著影响(P>0.05)。2)随着饲粮蛋白质水平的升高,氮摄入量呈显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01);组3的氮沉积率极显著高于组1(P<0.01),其他组间差异不显著(P>0.05)。3)粪氮排放量随饲粮蛋白质水平的升高逐渐增加,组2与组1、组3差异不显著(P>0.05),其他组间差异极显著(P<0.01);粪钙排放量以组3最低(5.04g/d),且极显著低于组5(P<0.01);粪磷排放量随饲粮蛋白质水平的升高逐渐增加,组1、组2、组3极显著低于组5(P<0.01),组4显著低于组5(P<0.05)。4)尿氮排放量随着饲粮蛋白质水平的升高逐渐增加,组2与组1、组3差异不显著(P>0.05),其他组间差异极显著(P<0.01);尿钙排放量以组3最低,为1.18g/d,比组1、组5分别降低0.53和0.78g/d;尿磷排放量组1显著低于组5(P<0.05),其他各组间差异不显著(P>0.05)。5)粪尿氮排放总量组5极显著高于其他组(P<0.01),粪尿钙排放总量组3极显著低于其他组(P<0.01),粪尿磷排放总量组1、组2极显著低于组5(P<0.01)。6)粪氮占比为72.44%~42.06%,随着饲粮蛋白质水平的升高逐渐降低,尿氮占比为27.56%~57.94%,随着饲粮蛋白质水平的升高逐渐升高;粪、尿钙和磷占比各组间差异不显著(P>0.05)。综合各项指标,在本试验条件下,当饲粮蛋白质水平为11.29%时,空怀期云南半细毛羊的氮沉积最佳,粪尿钙排放总量最低;饲粮蛋白质水平在一定范围(7.06%~11.56%)时对空怀期云南半细毛羊粪尿磷排放总量无显著影响;空怀期云南半细毛羊对钙、磷的排放以从粪中排放为主,多余的氮则主要从尿中以尿氮的形式排出。     

猪圆环病毒2型Rep、Cap蛋白基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

采用PCR方法克隆猪圆环病毒2型(PCV2)Rep和Cap蛋白基因,以串联的方式依次克隆到pMD18-T载体中.经鉴定后亚克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV.重组穿梭质粒用Pme Ⅰ线性化后与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183株内进行同源重组产生重组腺病毒质粒.将重组腺病毒质粒用Pac Ⅰ线性化后转染293细胞中包装成为完整的腺病毒.将构建的重组腺病毒按照每100μL 1×107蚀宽单位(PFU)滴鼻2次免疫6～8周龄BALB/c小鼠,经尾部采血获得一免、二免血清.用ELISA方法检测结果表明,该重组腺病毒可以诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体,可作为候选基因工程疫苗进行本体动物免疫试验研究.     

血小板源性生长因子(PDGF-BB)促进山羊骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化

将血小板源性生长因子(PDGF-BB)作用于骨髓间充质细胞,分别于5、7d后用抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体进行免疫组化分析,定量RT-PCR检测α-SMA mRNA的表达,透射电镜观察细胞超微结构。免疫组化结果显示,PDGF-BB诱导组表达α-SMA的细胞数约为95%,而对照组表达α-SMA的细胞数约为5%。免疫组化图象分析结果显示,5、7d PDGF-BB诱导组抗α-SMA着色平均灰度值小于对照组。RT-PCR结果显示,PDGF-BB诱导组有α-SMA mRNA表达,而对照组则没有。透射电镜显示,骨髓间充质细胞经过诱导后细胞浆内出现肌丝样结构。结果表明,PDGF-BB可以促进骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化。