1-O-Alkylglycerol Ethers from the Marine Sponge Guitarra abbotti and Their Cytotoxic Activity

The cytotoxicity-bioassay-guided fractionation of the ethanol extract from the marine sponge Guitarra abbotti, whose 1-O-alkyl-sn-glycerol ethers (AGEs) have not been investigated so far, led to the isolation of a complex lipid fraction containing, along with previously known compounds, six new lipids of the AGE type. The composition of the AGE fraction as well as the structures of 6 new and 22 previously known compounds were established using ¹H and ¹³C NMR, GC/MS, and chemical conversion methods. The new AGEs were identified as: 1-O-(Z-docos-15-enyl)-sn-glycerol (1), 1-O-(Z-docos-17-enyl)-sn-glycerol (2), 1-O-(Z-tricos-15-enyl)-sn-glycerol (3), 1-O-(Z-tricos-16-enyl)-sn-glycerol (4), 1-O-(Z-tricos-17-enyl)-sn-glycerol (5), and 1-O-(Z-tetracos-15-enyl)-sn-glycerol (6). The isolated AGEs show weak cytotoxic activity in THP-1, HL-60, HeLa, DLD-1, SNU C4, SK-MEL-28, and MDA-MB-231 human cancer cells. A further cytotoxicity analysis in JB6 P⁺ Cl41 cells bearing mutated MAP kinase genes revealed that ERK2 and JNK1 play a cytoprotective role in the cellular response to the AGE-induced cytotoxic effects.     

马媾疫锥虫SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种特异、快速的媾疫锥虫检测方法,本研究通过PCR方法从马媾疫锥虫动基体基因组中扩增得到395 bp的特异的保守序列,将其克隆到pMD-18T载体中构建重组质粒标准品,以10倍倍比稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立马媾疫锥虫荧光定量PCR的检测方法。结果表明:该方法的检测灵敏度可达到1拷贝/μL,并且与马属动物其他传染病无交叉反应。其组间及组内变异系数分别小于3.183%和3.842%。该方法的建立为快速及特异性检测马媾疫锥虫提供了有效的方法。     

利用RAPD技术分析内蒙古中东部草原三种针茅的遗传关系

利用RAPD分子标记技术对14份来自内蒙古中东部草原的贝加尔针茅(Stipa baicalensis Roshev.)、大针茅(S.grandis P.Smirn.)和克氏针茅(S.krylovii Roshev.)进行遗传多态性分析。筛选出16个引物,扩增出223条DNA片段,其中多态性片段为184条,多态性比率为82.51%。结果表明:14份材料呈现出明显的种间相似性,同一种针茅首先聚在一起;每一种针茅都获得了其特有的RAPD条带。     

青海省冬虫夏草采挖区与非采挖区土壤生态化学计量特征

为研究冬虫夏草采挖区与非采挖区的土壤生态化学计量学特征,本研究以青海省7个地区冬虫夏草生长地土壤样本为试验材料,分别采用重铬酸钾-外加热法、凯氏定氮法、碱熔法、碳酸氢钠浸提-比色法、酸溶法、1 mol·L^-1乙酸铵浸提-火焰光度计法、碱解-扩散法、邻菲啰啉比色法、火焰原子吸收分光光度法对土壤样本的养分与理化指标进行了测定,并对其化学计量特征进行了分析。结果表明,除XH(青海省海南藏族自治州兴海县)地区采挖区与非采挖区在全氮含量上存在显著性差异(P<0.05),其他各地区采挖区与非采挖区在土壤各指标含量上均无显著性差异,不同地区采挖区与非采挖区C∶N的范围是18.24~32.79,C∶P是155.53~562.78,N∶P是4.85~24.00,C∶K是4.51~11.52,K∶N是2.55~7.17,K∶P是31.44~81.86;采挖区与非采挖区的C∶P与N∶P之间均具有极显著相关性(P<0.01)。因此,本研究发现采挖冬虫夏草对其生长环境的土壤化学性质无显著性影响,为冬虫夏草采挖对生态环境的影响评估提供数据支撑。     

传染性造血器官坏死病毒焦磷酸测序检测技术的建立

根据传染性造血器官坏死病毒(IHNV)基因序列,设计了IHNV最为保守的指纹序列,以及测序引物,建立了IHNV焦磷酸测序检测方法。对所构建的IHNV焦磷酸检测方法进行特异性试验和灵敏度检测。结果表明,所建立的方法特异性好,在8种鱼类病毒中能够特异性检测出目的病毒,检测方法灵敏度高,最低检出核酸量为10pg/μL。对建立的焦磷酸测序检测方法进行了实际应用研究,选取国内采集与进口的鱼类样本共计80批次进行IHNV检测。结果显示,焦磷酸测序检测方法可以有效的检出常规RTPCR不能检出的假阴性样本和弱阳性样本,该方法的灵敏度和特异性可以满足水生动物疫病检测的需要。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒（AIV）A／Goose／HLJ／p46／2003（H5N1）的NSl基因，将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上，转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析，表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示，重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后，经0．3mmol／L的IPTG诱导，融合蛋白MBP-NS1得到大量表达，融合蛋白以可溶形式存在，分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明，融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应，而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法，为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及在 IBRS-2细胞内的表达

采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的基因,克隆入pMD18-T载体,转化至E.coliDH5α感受态细胞,经抗性平板筛选、小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定后,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1。然后筛选含有目的基因的重组质粒,并转染IBRS-2细胞,在G418压力下进行筛选,利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测表达情况。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank上相应基因序列(AJ132530)的一致性达99.9%,构建的真核表达质粒pcMIC3能在转染的IBRS-2细胞中表达分子量约为39.2ku的MIC3,且表达的蛋白质具有良好的免疫活性,为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定了基础。     

利用微滴数字PCR技术分析转基因大豆‘GE-J12’中外源基因的拷贝数

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lectin为参照,建立微滴数字PCR拷贝数检测体系。特异性试验结果显示,只有以抗除草剂转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板才有扩增信号。以单株转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板,进行外源目的基因G2-EPSPS和GAT、3′转化体特异性序列的微滴数字PCR检测,转基因大豆‘GE-J12’的外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值分别为0.99和1.01。同时3′转化体特异性序列的拷贝数均值为1.00,验证单株转基因大豆‘GE-J12’为纯合子,因此鉴定该单株转基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因组上为单拷贝插入,同时与Southern blot方法进行比较,结果一致。     

猪接种PRRSV Nsp2Δ1882-2241弱毒株后血清细胞因子的变化特征

为了解Nsp2Δ1882-2241缺失后弱化的高致病性PRRSV（TJM株）对宿主免疫学应答的刺激机理,本研究分析了免疫猪血清中的细胞因子及变化规律。将14头4周龄易感仔猪随机分为3组：第1组接种PRRSV TJM-F92株,为免疫组;第2组接种高致病性PRRSV TJ-F5毒株,为攻毒组;第3组不接种疫苗及病毒,为对照组。接种后28d,用TJ-F5毒株攻击试验猪,于不同时间点采集血样,用ELISA法测定血清中的PRRSV抗体、IL-2、IL-10、IL-12p40、TNF-α、IFN-α和IFN-β水平。结果显示：（1）与对照组和攻毒组相比,免疫组猪IL-12p40水平持续上调,于免疫后28d受PRRSV强毒攻击后,其水平开始缓慢降低,但仍高于攻毒后的对照组。（2）免疫组IL-2水平在接种疫苗后的前21d内无明显升高且低于攻毒组,在受到强毒攻击后其IL-2水平却有明显升高。（3）免疫组IL-10水平与对照组无明显差别,并在免疫14d后一直显著低于攻毒组（P〈0.01）。（4）免疫组接种疫苗后的前21d内,TNF-α水平保持稳定,28d明显上调。攻毒组TNF-α水平0～28d一直低于对照组,且在21d达到最低（P〈0.01）。免疫组在28d受强毒攻击后,其TNF-α水平下降且在攻毒7d时最为明显（P〈0.01）,此后恢复到正常水平。（5）免疫组免疫后28d时IFN-α水平升高,在受到强毒攻击后再次显著降低（P〈0.01）。免疫组IFN-β水平一直低于对照组和攻毒组,不因强毒攻击而变化。以上结果提示,IL-12上调在PRRSV免疫保护中起明显作用;另外,上调TNF-α及下调IL-10都是基因缺失疫苗发挥效力的潜在机制。