口蹄疫病毒非结构蛋白2C基因在昆虫细胞中的表达及应用

研究口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP) 2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面的意义.本研究将FMDV NSP 2C基因,克隆到穿梭载体pFast-bac- HT-B,将其转入含骨架载体Bacmid的DH10Bac,经蓝白斑筛选得到重组骨架质粒Bacmid-2C.将Bacmid-2C转染昆虫细胞Sf9,鉴定正确后,经3次增殖获得高滴度的P-3代病毒后,在High Five细胞中进行目的蛋白的表达.SDS-PAGE结果显示在High Five细胞中得到了相对分子质量约为38.93 ku的目的蛋白2C,Western blotting及Dot-ELISA结果显示,该表达产物对FMDV感染动物阳性血清有良好的反应性.以电泳纯化的2C蛋白为抗原建立间接ELISA,检测健康非免疫动物、免疫动物及FM-DV试验感染动物血清,结果表明2C-ELISA不但能区分免疫动物和感染动物的血清,而且还能检测FMDV感染早期动物血清中的2C抗体.说明昆虫细胞表达的2C蛋白可作为FMDV疫苗免疫动物与自然感染动物鉴别诊断的良好抗原.2C基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为建立通过检测几种NSP抗体,筛查感染及隐性带毒动物,净化畜群的方法奠定了基础.     

呼伦贝尔沙化草地人工固沙植物种间生态位关系研究

采用样方法对呼伦贝尔地区沙化草地不同恢复年限人工播种固沙区进行调查,并计算其主要植物的重要值、生态位体积及生态位重叠值,以研究呼伦贝尔沙化草地人工固沙植物群落特征及演替状况。结果表明:人工固沙植物冰草(Agropyron pectinatum(Bieb.)Beauv.)的平均生态位体积在时间尺度上,呈持续增加趋势,是改良沙化草地的优良草种;小麦(Triticum aestivum L.)与小叶锦鸡儿(Caragana microphylla Lam.)、冰草与羊柴(Hedysa-rum laeveMaxim)生态位重叠值为0.9213和0.7512,在演替过程中具较强的竞争作用。自然恢复植物与人工播种植物间,多数生态位重叠值不高。自然恢复多年生植物大针茅(Stipa grandis P.Smirn.)、糙隐子草(C1eistogenes squarrosa(Trin.)Keng)等逐渐出现,表明该地区植被群落结构向稳定共存的人工-天然植被群落结构方向发展。     

两株鸭源H1N3亚型流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

从2008年10月至2010年7月,每月定期在华东地区扬州活禽市场采集健康家鸭泄殖腔拭子,并从中分离鉴定了14株H1亚型禽流感病毒。对其中的2株病毒进行全基因测序和遗传演化分析,发现2株病毒均属于H1N3低致病性禽流感病毒。各基因遗传进化分析均与类禽猪流感的分离株的亲缘关系相对较近;除血凝素(haemagglutini,HA)基因外,其它所有的基因均发生了不同程度基因重组。其中H5N1病毒参与了多聚酶蛋白PB1与PB2基因的重组,H9N2病毒参与了PA基因的重组。     

典型草原三种蝗虫种群死亡率和竞争的研究

通过田间罩笼试验研究内蒙古典型草原3种蝗虫成虫种群死亡率和竞争。供试蝗虫分别为:亚洲小车蝗(Oedaleus asiaticus B.Bienko),宽须蚁蝗(Myrmeleotettix palpapis(Zub.))和短星翅蝗(Calliptamus abbreviatus Ikonn.)。结果表明:亚洲小车蝗和宽须蚁蝗食性相似,喜食禾本科牧草,而短星翅蝗则喜食菊科牧草,为了获取更多食物,短星翅蝗种内竞争强于亚洲小车蝗和宽须蚁蝗;30 d后在3种密度(24、16、8头/m²)下,亚洲小车蝗存活数均高于另两种,其竞争也强于另两种;3种蝗虫24头/m²死亡率均高于80%,其中短星翅蝗达86%,说明在高密度下有很强的种内竞争,随着密度的减少死亡率降低,种内竞争也随之减少;3种蝗虫混养时,亚洲小车蝗和宽须蚁蝗的死亡率比在单种时有所降低,而短星翅蝗死亡率比单种时则有所增加,表明亚洲小车蝗和宽须蚁蝗有较强的种间竞争,短星翅蝗的竞争较弱。     

山羊子宫内肽能神经分布及妊娠时的变化

采用免疫组化方法，研究了山羊子宫内含P物质（SP）和含血管活性肠肽（VIP）神经的分布。结果，妊娠及未妊娠山羊子宫颈内有粗细不等的神经束行经于外膜和肌层中，神经分支形成丛状分布于血管壁，子宫颈部未见SP神经元胞体及VIP神经元胞体；未妊娠山羊子宫角内SP神经和VIP神经均呈丛状围绕血管并分布于血管壁；妊娠中期的孕角和非孕角均有胎盘形成，除胎盘内无神经分布外，SP神经及VIP神经同样分支形成丛状分布于血管壁。结果提示，山羊子宫内SP神经和VIP神经主要支配子宫内血管，妊娠时除胎盘内无神经分布外，SP神经及VIP神经的分布无明显变化。     

新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞体外培养体系的建立

利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;通过接触抑制和解除抑制研究该类细胞的增殖潜力,免疫荧光进行鉴定;并通过脂质体介导对分离到的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞分别进行EGFP-N1和DsRed-N1基因转染。结果成功分离到新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,体外可以大量传代和冷冻,目前已经传至50代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性;转染48h后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光和红色荧光,表明瞬时转染新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞可以获得成功,其中转染DsRed-N1基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞已经传至60代以上。结果表明,本试验成功建立了新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞的体外培养体系,在体外能稳定培养和传代,并可以成功获得转基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞。     

马麝呼吸系统疾病病原学研究

采用病毒、真菌、细菌学及血清学等检验方法,对甘肃兴隆山马麝以出血性肺炎或纤维素性-化脓坏死性肺炎为主要特征的呼吸系统疾病的病原进行了系统研究。结果表明,马麝的呼吸系统疾病是由巴氏杆菌（P.multocida）单独感染或与大肠杆菌（E.coli）、绿脓杆菌（P.aeruginosa）混合感染的一种普通传染性疾病。药敏试验表明,这3种细菌均对苄星青霉素、硫酸链霉素、复方磺胺甲噁唑片、酒石酸泰乐菌素敏感,而对麦迪霉素不敏感。     

口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株基因组全长感染性克隆的构建

利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3'端覆盖口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBlueseriptSK+载体上.利用融合PCR扩增到基因组5'端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp),并将其连接至pGEM-T载体.最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo(+)中构建该病毒株的全长cDNA克隆.以构建的FMDV Asial/JS/China/2005株全长cDNA为模板,使用TTRNA聚合酶在体外转录得到病毒RNA,通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒.对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒.该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础.     

呋喃唑酮代谢物人工抗原的合成及抗体的制备

为改进和完善免疫检测呋喃唑酮代谢物方法,制备了抗呋喃唑酮代谢物(AOZ)特异性抗体.采用对醛基苯甲酸对AOZ进行衍生化得到CPAOZ,还原CPAOZ结构中的C=N双键得到半抗原,半抗原用N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法与BSA偶联制备免疫原,免疫新西兰大白兔制得特异性抗体,采用间接(竞争)ELISA法评价抗血清效价及特异性.结果显示,试验获得了较高效价(1∶1280000)的抗AOZ血清,AOZ半抑制浓度为5.9 ng/mL;抗血清与结构类似物呋喃它酮代谢物的交叉反应率仅为0.76％,与呋喃妥因代谢物和呋喃西林代谢物无交叉反应;利用该抗体建立的间接竞争ELISA检测法,AOZ在1～27 ng/mL与抑制率呈线性关系.结果表明,该特抗体虽然灵敏度较低,却对AOZ而非AOZ衍生物有特异性,可为畜产品中AOZ残留检测提供新的思路和方法.     

粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)培养细胞对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的吞噬过程观察

观察微孢子虫在非天然宿主细胞系的生物行为过程,有助于探究微孢子虫的侵染特异性机制。选用鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni,Tn)细胞系为材料,接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)孢子后观察其吞噬过程。结果发现:经氢氧化钾发芽预处理的Nb孢子虽然可以在Tn培养细胞液中发芽,但未见发芽孢子的孢原质进入Tn培养细胞;在接种Nb孢子浓度为2.0×105mL-1以上时,观察到孢子通过内吞作用进入了Tn培养细胞,但未见孢子的增殖;随着时间的延长和进入Tn培养细胞的Nb孢子的增加,可引起Tn培养细胞的超微结构变化,并导致细胞的裂解。以上结果说明,虽未见Nb以发芽形式感染Tn培养细胞,但Nb能够被吞噬进入Tn培养细胞并破坏其结构。