过表达MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

旨在探究肌球蛋白结合蛋白C1（myosin binding protein C1,MyBPC1）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究MyBPC1在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。本研究利用西门塔尔胎牛原代牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型模拟牛骨骼肌的生长发育过程。采用qRT-PCR和Western blot检测MyBPC1的细胞时序表达谱。试验分为两组。在RNA水平每组4个重复,每个重复20 μL;在蛋白水平每组3个重复,每个重复15 μg。采用qRT-PCR和Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞转染MyBPC1的过表达效果,并进一步检测细胞增殖期标志因子Pax7、Ki67以及细胞分化期标志因子MyHC、MyOG的表达变化情况,观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态。结果,MyBPC1在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在极显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后MyBPC1的mRNA和蛋白表达量均极显著高于增殖期（P<0.01）。过表达MyBPC1后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,增殖标志因子Pax7的mRNA水平和蛋白表达水平无显著差异,分化标志因子MyHC的mRNA水平和蛋白表达水平极显著高于对照组（P<0.01）。过表达MyBPC1可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化,为进一步开展MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞的调控机制奠定基础。     

口感化及颗粒化开食料对早期断奶羔羊生长和胃肠道发育的影响

分析探讨口感化及颗粒化开食料对早期断奶羔羊生长和胃肠道发育的影响。选取新生健康的双羔湖羊公羔42只,随机分为两组,分别饲喂颗粒化和口感化开食料,试验期42 d。两组羔羊21日龄之前的采食量、体重和绝对生长的变化趋势相似。21日龄以后,口感化开食料组羔羊的采食量、体重、绝对生长和相对生长均明显高于颗粒化开食料组,42日龄体重、后两周的采食量及15～21日龄的相对生长率在两组间有显著差异(P < 0.05)。口感化开食料还显著提高(P < 0.05)了羔羊42日龄时的育肥指数、体长指数、胸围指数、管围指数和断奶前的瘤胃质量和瘤胃/胴体。以上结果表明,与颗粒化开食料相比,口感化开食料更有利于羔羊早期断奶前后的瘤胃发育、采食量提高、体重和体尺的发育,但对其他胃室及肠道发育没有影响。     

生物炭与秸秆还田对风沙土壤-微生物-胞外酶化学计量特征的影响

以宁夏贺兰山东路风沙土壤为研究对象,分析等碳量秸秆、生物炭还田后土壤、微生物、胞外酶及其化学计量特征,为农田养分调控和土壤可持续利用提供科学依据.结果表明,随着秸秆和生物炭还田量的增加土壤有机碳(C)、全磷(P)、速效氮(AN)、速效磷(AP)浓度显著增加,且生物炭还田优于等碳量秸秆处理.而秸秆与生物炭还田对土壤全氮(N)浓度影响不显著.土壤C/N、C/P、N/P、AN/AP变化范围在10.1～10.9、7.4～8.2、0.7、2.7～3.4.且N/P、AN/AP随秸秆还田量的增加显著增加,随生物炭还田量的增加显著降低.生物炭还田后土壤微生物生物量碳(MBC)、微生物生物量氮(MBN)、微生物生物量磷(MBP)含量显著高于等碳量秸秆还田.而秸秆还田后土壤微生物与胞外酶化学计量比均显著高于等碳量生物炭还田.相关性分析表明,秸秆还田后土壤AN与碱性磷酸酶(AKP)极显著负相关,与β-葡糖苷酶(BG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、β-乙酰葡糖胺糖苷酶(NAG)、MBC、(BG+CBH)/AKP、(NAG+LAP)/AKP、MBN/MBP极显著正相关.生物炭还田后土壤AP与BG、α-纤维素酶(CBH)、LAP、NAG、MBC、MBN、(BG+CBH)/AKP极显著正相关,与MNC/MBN极显著负相关.综上,生物炭还田有利于提高土壤养分浓度和微生物量,而秸秆还田更有利于维持土壤养分平衡.     

北方蚁(Formica aquilonia)对山地草甸土壤种子库的影响

为明确北方蚁影响下蚁巢及其周围土壤种子库变化特征,以山地草甸中广泛分布的北方蚁为研究对象,探究距蚁巢不同距离、不同深度下土壤种子库的特征,以及土壤环境对种子库物种分布的影响.结果表明:蚁巢中心及周围土壤种子库中共出现28个物种,隶属12科28属,其中禾本科植物居多,蚁巢中心0～10 cm、10～20 cm深度下,土壤中平车前、北疆剪股颖、无芒雀麦、鸭茅、草地早熟禾萌发数量均显著高于其他样点(P<0.05);土壤种子库物种生活型组成以多年生草本植物为主,蚁巢中心0～10 cm、10～20 cm深度下多年生草本植物数量均显著高于其他样点(P<0.05);蚁巢中心0～10 cm、10～20 cm深度土壤种子库种子数量和物种数均显著高于蚁巢周围区域(P<0.05).相同距离下,0～10 cm深度土壤种子库种子数量及物种数均高于10～20 cm深度;蚁巢大小与蚁巢中心土壤种子库种子数量呈极显著正相关(P<0.01);随着距离的增加,同深度下土壤种子库丰富度指数、多样性指数、优势度指数、均匀度指数大致呈现出"V"字型变化趋势,并在距蚁巢100 cm处物种多样性指数降至最低;RDA分析表明,土壤速效磷是影响该区土壤种子库分布的主要因子.北方蚁能对周围环境中的种子进行收集与搬运,增加了蚁巢内种子的数量,影响了周围环境中土壤种子库的空间分布,在小尺度范围内进行了种子再分配,改变了土壤种子库内的物种分布.     

猪miR-199a-5p对脂质生成的影响及其靶基因的预测和分析

本研究旨在分析miR-199a-5p对猪肌内脂肪细胞脂质生成的影响及作用机制。采集淮南猪不同育肥时期(育肥前期、中期和后期)的背最长肌和皮下脂肪组织,通过实时荧光定量PCR分析其表达变化趋势;合成miR-199a-5p的mimics,转染猪原代肌内脂肪细胞,诱导分化后通过油红O染色观察过表达miR-199a-5p对脂质生成的影响;结合之前筛选到的脂肪型和瘦肉型猪差异表达mRNAs、lncRNAs和circRNAs,使用miRanda软件筛选miR-199a-5p的靶分子,并用GO和KEGG富集分析法对这些mRNAs、lncRNAs的共表达基因和circRNAs的来源基因进行功能分析。结果显示,随着育肥进程,miR-199a-5p在背最长肌中表达量持续上调,而在皮下脂肪组织中表达量先下调后上调;过表达miR-199a-5p可抑制肌内脂肪细胞的脂质生成。共筛选到9个mRNAs、5个lncRNAs和1258个circRNAs包含miR-199a-5p结合位点,GO分析主要富集于内质网和肌动蛋白结合,KEGG分析发现主要富集于糖、脂质和蛋白质代谢。提示miR-199a-5p可能通过与lncRNAs和circRNAs互作间接调控靶基因,参与调控肌肉发育、脂质生成和代谢,可作为影响肉质性状的候选miRNA。     

湖羊羔羊早期断奶前后瘤胃发酵与微生物区系的变化

本试验旨在研究湖羊羔羊早期断奶前后的瘤胃发酵与微生物区系变化,为幼龄反刍动物瘤胃发育变化理论以及羔羊的早期培育等提供依据。选择初生重接近的湖羊公羔(3.81 kg±0.55 kg)16只,1~7日龄饲喂母乳,8日龄与母羊分离,开始饲喂代乳粉(按8日龄体重的2%,分3次等量饲喂)和开食料(自由采食),35日龄断奶。分别于断奶前(21日龄)、后(42日龄)各选择5只羔羊进行屠宰,采集瘤胃内容物,测定瘤胃发酵、酶活和微生物区系。结果表明,断奶后羔羊的瘤胃总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸及纤维素酶和α-淀粉酶活性均极显著高于断奶前(P<0.01)。断奶后瘤胃菌群多样性和丰富度均低于断奶前(P<0.05)。断奶前后的优势菌门均为拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes),其中,拟杆菌门为第一优势菌门,在断奶前后分别占61.96%和65.36%,厚壁菌门为第二优势菌门,在断奶前后分别占32.08%和24.03%;两菌门之和在断奶前后分别占瘤胃总菌门的94.04%和89.39%。断奶前后的优势菌属均为unidentified_Prevotellaceae,分别占21.85%和38.49%。断奶前后羔羊瘤胃微生物的功能没有显著变化,都主要集中在复制和修复、碳水化合物代谢和翻译等途径。以上结果说明,羔羊早期断奶后的瘤胃发酵和酶活增强,菌群多样性和丰富度有所降低,在早期断奶前后的优势菌群和功能相似。     

奶牛场温室气体排放与减排措施

奶牛养殖在产能提升的同时也排放了大量温室气体。本文梳理了奶牛养殖场温室气体排放的重点环节,主要分为奶牛养殖活动温室气体排放以及牛场日常运行耗能两个方面;结合奶牛养殖肠道发酵和粪污管理的温室气体核算方法,归类整理了主要的减排措施,包括进行提高饲料质量和转化效率、粪污高效管理、清洁能源替代等方式,助力奶牛养殖实现低碳乃至零碳排放。     

绵羊BMP15基因B2突变可视化检测技术的建立

骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）基因突变对绵羊排卵率、产仔数以及繁殖力有很大影响,本研究旨在建立快速可视化检测BMP15基因B2突变的技术。将改良的扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）与核酸染料SYBR Green Ⅰ结合,针对BMP15基因B2突变设计ARMS特异性引物,使引物下游3'端的最后一个碱基为A,并在下游引物3'端的第3位碱基处设计额外的错配,以提高引物的特异性;经ARMS PCR扩增后,向产物中加入SYBR Green Ⅰ,通过肉眼观察PCR管内的颜色变化来检测BMP15基因的B2突变。经测序发现所采集的样本均为野生型,因此,利用重叠延伸PCR构建BMP15基因B2突变型模板,测序结果显示BMP15基因B2突变型模板构建成功。ARMS PCR结果显示,ARMS特异性引物能够只扩增突变型模板,而不会扩增野生型模板,且扩增效果良好。ARMS PCR扩增后加入SYBR Green Ⅰ发现已知野生型模板与阴性对照一致,呈SYBR Green Ⅰ原始颜色橙黄色,而已知突变型模板呈亮绿色,且色差明显,肉眼可辨。用建立的可视化检测BMP15基因B2突变的技术检测50个小尾寒羊基因组DNA （随机向其中20个样本中加入构建的BMP15基因B2突变型模板）,将可视化检测的突变型样本编号与混合样本时记录的编号对比,结果表明该技术能够准确检测绵羊BMP15基因的B2突变,且准确率高达100%。将构建的BMP15基因B2突变型的模板进行梯度稀释,对本试验可视化检测体系的灵敏度进行检测,发现ARMS可视化检测技术的灵敏度达到0.006 ng/μL。因此,本研究建立的技术能够可视化地检测绵羊BMP15基因B2突变,且准确率高,有望为高繁殖力绵羊的选育提供技术支持。     

芩术安胎散的毒性和临床安全性试验研究

试验通过对芩术安胎散的急性毒性、亚慢性毒性和临床安全性进行研究,为芩术安胎散对家猫先兆性流产的预防与治疗提供参考。急性毒性试验：制备芩术安胎散药液,取6周龄健康昆明小白鼠60只,随机分为5组,每组12只,第1~4组的给药剂量分别为6 000、4 800、3 840和3 072 mg/kg,对照组给予等量纯净水,10 d内观察有无中毒和死亡,计算半数致死量（LD₅₀）;另取6周龄健康昆明小白鼠20只,随机分为2组：试验组给予2.0 g/mL芩术安胎散药液,18 h内灌服3次,每次0.8 mL,对照组给予等量纯净水,给药后饲养7 d,计算最大耐受量（MTD）。亚慢性毒性试验：24只7周龄SD雌性大鼠随机均分为高、中、低剂量组和对照组,在30 d内,每日分别给予4 800、2 400和1 200 mg/kg芩术安胎散,对照组以等量纯净水进行灌胃,每日观察和记录各组大鼠的精神状态、有无中毒症状和死亡;第31天对各组大鼠称重、采血,进行血液学检测,剖检各组大鼠,观察主要脏器有无病变并制作病理切片。临床安全性试验：选取2~5岁健康雌性家猫20只,适应性饲养10 d,随机分组,每组5只,分别为低剂量组（1倍临床推荐剂量：1.15 g/kg）、中剂量组（3倍临床推荐剂量：3.45 g/kg）、高剂量组（5倍临床推荐剂量：5.75 g/kg）及空白对照组,将药物置于胶囊内,口服给药,空白对照组给予空胶囊,每日1次,连续给药7 d,每日观察各组家猫食欲、精神状态及排便情况,于第8天对各组家猫进行静脉采血,检测血常规和血液生化指标。结果显示,急性毒性试验无小鼠死亡,LD₅₀>6 000 mg/kg;小鼠对芩术安胎散的最大耐受量为240 g/kg,表明该受试药物无明显毒性。在亚慢性毒性试验中,各组大鼠的生长发育情况、血常规指标、脏器系数与对照组相比均无显著差异（P>0.05）;高、中剂量组与低剂量组、对照组相比血清总胆固醇含量显著下调（P<0.05）,除此之外的生化指标均无显著差异（P>0.05）。病理剖检和组织切片观察结果显示,高剂量组大鼠主要组织器官与对照组相比无明显异常。在临床安全性试验中,不同剂量组家猫精神状态、被毛光泽度、粪便情况均正常,血液学指标与对照组相比差异均不显著（P>0.05）。本试验结果表明,中药芩术安胎散无明显毒性,家猫按临床推荐剂量使用是安全的。     

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D 蛋白免疫 BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明, S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示, 腹水的抗体效价达到了1∶1 000 000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV) 5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与 PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究 PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。