盐胁迫对桉树(Eucalyptus)活性氧代谢和CAT基因表达的影响

桉树耐贫瘠,盐胁迫影响桉树的生长速率,严重时造成桉树枯萎死亡。本研究以‘广林9’三月龄组培苗为材料,分别用不同浓度NaCl溶液(0, 30 mmol/L, 60 mmol/L, 90 mmol/L, 120 mmol/L, 150 mmol/L)处理20天后,检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、过氧化物酶(peroxidase, POD)活性、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性、过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)含量、丙二醛(malonaldehyde, MDA)质量摩尔浓度等生理指标以及CAT基因的转录变化。NaCl处理后,MDA质量摩尔浓度、H2O2含量显著升高,在90 mmol/L或120 mmol/L处达到最大值;盐胁迫下POD、SOD和CAT活性均表现为先升高后降低的趋势,并且在90 mmol/L NaCl时达到最大值。设无NaCl处理下CAT基因的表达水平为1,用qPCR (real-time quantitative PCR)方法分析不同盐胁迫下6个CAT基因的相对表达水平。随着NaCl浓度增大,CAT1、CAT2和CAT3的相对表达水平呈逐渐降低的趋势,NaCl浓度为30 mmol/L相对表达水平最高,分别为1.54、6.38和1.27;CAT5和CAT6的相对表达水平在120 mmol/L NaCl时达到最大值,分别为2.65和2.21;CAT4的相对表达水平随NaCl浓度增大而增大,并在NaCl浓度为150 mmol/L时显著升高,相对表达水平达3.31。结果表明:90~120 mmol/L NaCl浓度为桉树的耐盐胁迫的极限;盐胁迫会引起桉树ROS (Reactive oxygen species)代谢失衡,积累H2O2导致膜脂过氧化;6个CAT基因在不同盐胁迫强度下的转录变化差异显著,响应机制不尽相同。本研究可为桉树应答盐胁迫机理研究和桉树栽培管理提供参考。     

尾叶枝叶组织中8个人工启动子转录特性

理想病原诱导型启动子可准确调控抗病基因的时空表达,在植物抗病基因工程中起着关键作用。将4个病原诱导元件F-box、S-box、Gst1-box、W-box和Mini35S片段组合得到8个人工病原诱导启动子(synthetic pathogen-inducible promoters,SPIP),按元件排列顺序命名为,FSGW、FSWG、GWFS、GWSF、SFGW、SFWG、WGFS、WGSF。再用其分别替换pBI121中控制gus表达的35S启动子得到重组质粒后导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101。用农杆菌渗入法转化尾叶桉(Eucalyptus urophylla)叶盘,12 h后用GUS染色法检测启动子本底活性。其余叶盘用水杨酸,青枯菌,疫霉菌孢子诱导处理12 h后,提取总RNA、反转录得cDNA,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测人工启动子的诱导转录特性。GWFS和SFWG对应的叶盘GUS染色较为明显,本底活性相对较高,其余6个启动子本底活性较低,对应的叶盘不着色或着色浅。设CaMV35S的转录活性为1,qPCR结果显示:受水杨酸诱导时,GWSF和SFWG活性升高明显,分别为0.931和1.362;受青枯菌诱导时,WGFS活性升高到0.945;受疫霉菌孢子诱导时,GWFS、SFGW和WGFS活性升高明显,分别为2.030、1.979和2.351。结果表明:病原诱导元件的排列组合显著影响人工启动子的转录特性;8个启动子中WGFS具有本底低、诱导活性相对较高的优点,将其进一步优化后可应用于植物转基因抗病育种。     

汞胁迫对桉树3个保护酶活性及基因表达的影响

以广林9号桉（GL9）3月龄幼苗为材料,用0、25、50、75 μmol/L HgCl₂溶液（对应对照、低、中、高浓度）连续浇灌处理15 d后,测量株高,检测叶片叶绿素和丙二醛（MDA）含量、测定过氧化物酶（class Ⅲ peroxidases,POD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPX）的活性,分析9个保护酶基因的转录变化,探讨汞胁迫对保护酶活性及基因表达的影响。处理后各组间的株高、叶绿素含量无显著性差异。高浓度Hg²⁺处理使MDA含量升高到对照的3.35倍,达27.88 nmol/g。与对照相比,Hg²⁺处理后GPX活性降低,POD和CAT活性在25 μmol/L Hg²⁺处理下最高。从3类保护酶基因中的酶类选出3个基因进行qPCR分析。Hg²⁺处理后POD3、CAT2、GPX1的转录上调且低浓度处理上调更显著,其他6个基因的转录则呈下调趋势。设对照中基因的相对表达量为1,低浓度Hg²⁺处理后这3个基因的相对表达量分别为6.81、4.58和2.56,高浓度Hg²⁺处理后的相对表达量分别为2.31、2.02和1.08。结果表明,Hg²⁺胁迫影响保护酶活性使膜脂过氧化加剧,低浓度的Hg²⁺诱导POD3、CAT2和GPX1基因转录上调,增强桉树对汞胁迫的适应性。     

大肠杆菌感受态细胞的少量制备方法及转化条件研究

[目的]提高大肠杆菌感受态细胞的转化效率。[方法]根据普通实验室的试验条件,总结出1种少量制备大肠杆菌感受态细胞并高效率转化质粒的方法。[结果]利用该方法少量制备大肠杆菌感受态细胞,在OD600nm值为0.3～0.6时均可达到高转化率的效果。与常用的大量制备法相比,该方法的转化率提高100～300倍。[结论]该方法简单方便、重复性好、转化效率高、成本低,能够满足基因库的构建、分子克隆等研究的要求,是从事基因克隆研究方面的科研人员的良好选择。     

转TSRF1基因尾叶桉的培育及其广谱抗病性

以尾叶桉U6无性系无菌种子苗下胚轴为外植体,通过对不同生长调节剂的优化组合,建立尾叶桉高效再生体系.应用正交试验设计,优化尾叶桉遗传转化体系.经PCR和Southern杂交检测表明,TSRFI基因已整合到尾叶桉基因组中;转基因植株灌根接种青枯菌后,转基因植株表现出发病延迟,抗性提高,抗性相关酶活性显著增强.转化植株离体叶片对疫霉菌抗性明显增强.荧光定量PCR的结果表明转基因植株接种致病菌后TSRF1基因表达量得到提高.研究结果表明,转TSRF1基因尾叶桉表现出一定的广谱抗病能力.     

不同诱导因子对膜脂过氧化与对超微结构影响的关系

为了阐明诱导因子诱导系统获得性抗性机制,研究了百草枯PQ,钛铁试剂Tiron和稻白叶枯菌弱毒株XOO75-1等诱导因子对稻白叶枯病的系统获得抗性、诱导叶活性氧代谢及挑战接种叶超微结构的影响.结果表明,PQ和XOO75-1可诱导系统获得抗性.XOO75-1使处理稻叶SOD和CAT活性降低,使POD活性、O2i产生速率及MDA含量升高;PQ使SOD,CAT,POD活性、O2i产生速率及MDA含量升高;两者均使处理稻叶膜脂IUFA降低,饱和脂肪酸相对含量升高.PQ和XOO75-1使挑战接种叶病斑附近组织结构受保护,比未处理叶的细胞结构损伤小,较接近正常叶,细胞内结构以叶绿体变化最为显著.Tiron处理使PQ和XOO75-1诱导的系统获得抗性减弱,诱导局部的活性氧变化减小以及病斑附近的结构改变更显著.证明O2i在XOO系统获得抗性中起重要作用.     

3种抗生素对尾巨桉愈伤组织诱导及植株再生的影响

【目的】研究潮霉素、卡那霉素和头孢霉素对尾巨桉愈伤组织诱导、不定芽分化及生根的影响,确立抑制农杆菌生长的头孢霉素质量浓度。【方法】以尾巨桉无菌苗茎段为外植体,先后接种于添加不同质量浓度抗生素的愈伤组织诱导培养基、不定芽诱导培养基以及生根培养基上,统计愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和不定芽生根率,观察头孢霉素对农杆菌生长的影响。【结果】(1)培养基中的潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,200 mg/L时,尾巨桉外植体的愈伤组织诱导率分别为6.7%,12.1%和26.7%;(2)潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,250 mg/L时,不定芽分化受到明显抑制,不定芽诱导率分别仅有2.6%,10.2%和7.6%;(3)潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,250 mg/L时,不定芽生根困难,生根率分别为10.2%,16.2%和10.1%;当头孢霉素质量浓度≥200 mg/L时,农杆菌生长被完全抑制。【结论】尾巨桉对不同抗生素的敏感性存在差异,在尾巨桉遗传转化过程中,抗性愈伤组织与不定芽诱导的潮霉素适宜质量浓度为10 mg/L,卡那霉素为20 mg/L;生根诱导适宜的潮霉素和卡那霉素的质量浓度分别为15 和25 mg/L;抑制农杆菌生长的头孢霉素较适宜的质量浓度为200 mg/L。     

DPI对尾叶桉愈伤组织诱导和抗氧化酶活性的影响

将不同浓度DPI添加到尾叶桉(Eucalyptus urophylla)愈伤组织诱导培养基中,分析DPI对其愈伤组织诱导和SOD、POD、CAT、APX 4种抗氧化酶活性的影响。结果表明,高于1.5μmol/L的DPI显著抑制尾叶桉愈伤组织的诱导,0~0.25μmol/L的DPI能减轻褐化,0.1μmol/L DPI抗褐化效果最好,褐化率仅9.82%。0~0.25μmol/L的DPI处理后,尾叶桉APX活性随DPI浓度升高而升高,SOD、POD、CAT活性随DPI浓度升高呈先升高后降低的趋势。添加0.10μmol/L DPI可提高保护酶活性,减轻褐化,促进尾叶桉愈伤组织诱导。     

粗皮桉的组织培养与植株再生研究

[目的]研究不同植物生长调节剂组合对粗皮桉茎段愈伤组织诱导及再生的影响,为建立粗皮桉再生体系和粗皮桉商品化育苗提供参考.[方法]以粗皮桉茎段为外殖体,通过对不同植物生长调节剂组合的优化,建立粗皮桉再生体系.[结果]在MS培养基上添加2.0 mg/L PBU和0.05 mg/L IAA,21d后,外植体愈伤组织诱导率达98.4％;将愈伤组织接种在添加0.8 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的1/2MS培养基上,诱芽率高达86.0％;用1/2MS培养基添加0.8 mg/LPBU与0.1 mg/L NAA诱导粗皮桉不定芽增殖,用1/2MS培养基附加0.5 mg/L IBA和0.5 mg/L NAA诱导生根,炼苗15d后,组培苗移栽到黄心土与腐殖质土质量比为1∶1的基质中,成活率高达95.0％.[结论]2.0 mg/L PBU和0.05 mg/L IAA是诱导粗皮桉愈伤组织的最适植物生长调节剂组合,添加0.8 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的1/2MS培养基诱芽效果最好,添加0.1 mg/L NAA 、0.8 mg/L PBU组合时,芽增殖、生长情况较好,添加0.5 mg/L NAA 、0.5 mg/L IBA组合时生根效果最佳.     

脲类细胞分裂素诱导尾叶桉愈伤组织分化过程中SOD活性及基因表达变化

探讨3种脲类细胞分裂素(UCTK):N-苯基-N-噻唑基脲(PBU)、苯基噻二唑脲(TDZ)和氯吡苯脲(CPPU))诱导尾叶桉(Eucalyptus urophylla)愈伤组织分化的效果及作用机理。将下胚轴接种在含0.57μmol/L 6-BA+0.57μmol/L IAA的SPCa培养基,再添加4μmol/L的单种UCTK或浓度各为2μmol/L的UCTK间的两两组合。8周后,UCTK组合诱导所得再生型愈伤组织比例均高于49.27%,显著高于单种UCTK的不到29%。与单种UCTK处理相比,UCTK组合诱导的愈伤组织H₂O₂质量摩尔浓度降低、超氧阴离子清除速率下降、SOD活性则无规律性变化。与PBU处理相比,UCTK组合使6周龄愈伤组织的6个SOD基因的转录全部上调。设PBU+CPPU组合诱导所得2周龄愈伤组织中对应基因表达值为1,分析UCTK组合诱导愈伤组织膨大和分化过程中SOD基因的表达变化,发现SOD1和SOD3基因的转录变化最为显著。CPPU+TDZ处理2周后,SOD1和SOD3的转录达最大值,分别为762.53和1 119.82...