口蹄疫病毒O/Laos/00株非结构蛋白3A基因特征分析

经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增得到口蹄疫病毒O/Laos/00株的非结构蛋白3A基因核苷酸序列,与其他8株代表性参考毒株的3A基因进行比较,分析口蹄疫病毒3A基因的特征.结果表明:O/Laos/00株3A基因含有429核苷酸,编码143氨基酸残基.9株病毒3A氨基酸序列相比较,可分成3种不同的类型:一类是具有全长3A的毒株,一类是具有133～143位氨基酸缺失的毒株,这两类毒株均来源于牛体,核苷酸差异小(＜15 %);另一类是具有93～102位氨基酸缺失的毒株,毒株相互之间核苷酸差异较大(7.25 %～22.2 %).     

云南山羊痘流行毒株P32基因的克隆与表达

山羊痘是由山羊痘病毒引起的一种严重的、高度接触传染的动物疾病,被国际兽疫局(OIE)列为A类动物传染病.临床上以体温升高、全身性或局部性皮肤痘疹及内脏病变(特别是肺)乃至死亡为特征.山羊痘病毒(GTPV)属痘病毒科脊索动物亚科羊痘病毒属的成员,该属其他成员还有绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(LSDV).P32抗原是一种结构蛋白抗原,包含有一个主要的抗原决定簇,存在于所有的羊痘病毒属的3个成员中.针对山羊痘病毒与副痘病毒属存在免疫交叉反应,缺乏有效的鉴别诊断试剂盒,本研究克隆表达出羊痘病毒属特异的P32蛋白,为进一步研制抗体及抗原检测试剂盒奠定前期工作基础.     

山羊痘云南流行毒株的分离鉴定及P32基因PCR-RFLP分析

应用牛睾丸细胞,从12份采集自云南省不同疫点的山羊痘病羊肺脏中分离获得3株可疑毒株.这3株流行毒株经本动物回归试验、PCR鉴定及P32基因PCR-RFLP分析后确诊为山羊痘病毒,并据分离地被命名为MYS、XW、XD毒株.     

流行性出血病病毒血清分型RT-PCR方法的建立及应用

以决定流行性出血病病毒(EHDV)血清型的第二基因节段(Seg-2)为检测靶基因,设计7对特异性引物,建立用于鉴定EHDV血清型的RT-PCR检测方法,并通过对扩增产物的测序,进一步了解病毒Seg-2的遗传特性。特异性试验结果显示,该检测方法可准确鉴定不同血清型的EHDV毒株,与蓝舌病病毒、中山病病毒、阿卡斑病毒均无交叉反应;灵敏度试验结果显示,对不同血清型EHDV核酸的检测下限均可达10~2拷贝;对我国不同时间与不同地域分离的EHDV毒株进行血清型RT-PCR鉴定,结果显示分离的31株EHDV分属EHDV-1、-5、-6、-7与-10型等5种血清型,与血清中和试验的鉴定结果完全吻合。以上结果表明,该方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,可快速准确地鉴定EHDV毒株的血清型。     

O型口蹄疫兔化弱毒YNTBa株感染的牛原代睾丸细胞基因表达分析

为分析口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)减毒株感染天然宿主细胞后基因表达变化,将O型FMDV兔化弱毒株YNTBa接种初生犊牛原代睾丸细胞(BT),采用二代测序技术对YNTBa感染BT细胞后8 h和24 h的细胞转录组进行研究。结果显示：病毒感染8 h和24 h的试验组较对照组分别筛选出437和134个表达变化≥2倍的差异表达基因。基因本体论(GO)功能类聚分析显示,差异表达基因主要参与到细胞分化、DNA转录、细胞因子产生和凋亡等。京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能富聚分析表明,差异表达基因主要与细胞代谢、核糖体、吞噬体、蛋白消化吸收、细胞分化、细胞转录调控等相关,涉及糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素17(IL-17)、转化生长因子β(TGF-β)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、促性腺激素释放激素(GnRH)、雌性激素(estrogen)和催产素(oxytocin)等多条信号通路。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证了其中12个差...     

非洲猪瘟的风险防控及综合防控举措

2007年以来,非洲猪瘟在全球多个国家发生,2018年8月首次传入我国,传入后仅3个月就已造成我国生猪产业直接或间接损失达到几十亿元,给我国生猪产业带来了灾难.本文通过对非洲猪瘟传入我国的潜在风险点进行分析,为非洲猪瘟疫情防范工作提供可行性建议,为各养殖场做好非洲猪瘟综合防控工作提供参考.     

山羊痘云南流行毒株及疫苗株P32基因序列分析

将本实验室分离到的山羊痘病毒云南流行毒株MYS、XW、XD及疫苗株VF4主要结构蛋白基因P32基因克隆到PMD18T载体后进行双向测序,所得序列与Genbank中羊痘病毒属成员:山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(SLDV)参考毒株相应序列作对比分析(ByClustalWMethod),结果显示:(1)MYS、XD毒株P32基因全长969bp,疫苗株VF4为974bp,XW毒株为975bp。(2)XW、疫苗株VF4在100～105bp位置处均插入6个A,在947bp位置缺失一个T;SPPV参考毒株在169～171bp位置插入GAT。(3)由于疫苗株VF4P32基因核苷酸序列第414位置处发生了T/A突变,在该处形成一个新的终止密码子TAA,导致完整的开放读码框架(ORF)被打断,只表达第1～411bp(137个Aa)的基因片段,而不能表达出完整的P32蛋白。其余6株毒株的开放读码框架均很相似。(4)在所构建的系统发生树中,LSDV与SPPV参考毒株、MYS和XD株、VF4和XW株、GTPV参考毒株各被划分为一组。所有7个毒株P32基因核苷酸序列的同源性都很高,均在97%以上。其中疫苗株VF4与SPPV参考毒株的同源性最低,为97.6%。XD与XW毒株的同源性最高,为99.8%。(5)酶切位点分析结果显示,MYS、XW、XD、VF4及GTPV和SLDV参考毒株具有唯一的HinfI酶切位点,大约在第694bp位置。SPPV参考毒株具有2个HinfI酶切位点,分别在第391bp和691bp位置处,该酶切位点较适合用来鉴别山羊痘和绵羊痘病毒,而疙瘩皮肤病在临床上就很容易与山羊痘和绵羊痘鉴别开来。     

H5亚型禽流感病毒反应原性差异及ELISA检测方法的研究

在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,建立了H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法。通过分析不同单克隆抗体与不同禽流感毒株的反应性差异,筛选高特异性和高敏感性的H5亚型单克隆抗体。优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶标抗体的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与斑点ELISA、H5N1多重RT-PCR或病毒分离鉴定的结果相比较,同时使用该方法对野外样品进行了检测。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒。     

土杂鸡传染性鼻炎和鸡慢性呼吸道病混合感染的诊治

为了诊断维西县某土杂鸡养殖场发生的呼吸道疾病,对发病的土杂鸡采集喉气管、肺脏、脾脏等组织样品,通过PCR/RT-PCR进行新城疫、禽流感、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、鼻气管鸟杆菌病、传染性鼻炎和慢性呼吸道病等传染性疾病的病原核酸检测。结果表明:鸡群所患疾病为鸡传染性鼻炎和慢性呼吸道病混合感染,使用磺胺类药物和替米考星联合治疗获得了较好的治疗效果。     

2株云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因序列分析

在2019年1月-2019年6月对云南出现呼吸道疫病的57个鸡场进行H9亚型禽流感检测的基础上,选取石林和楚雄2个H9亚型禽流感阳性样品进行病毒分离。从分离的H9N2亚型禽流感病毒感染鸡胚尿囊液中提取总RNA,采用特异性引物经反转录PCR分别扩增HA和NA基因,PCR产物纯化后进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,云南2株H9N2毒株HA基因核苷酸序列同源性为94.2%,NA基因核苷酸序列同源性为93.6%,系统进化分析表明云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因均属于欧亚谱系中的类ADKHKY28097分支（Y280-like）,ACKYN12019和ACKYN72019 HA基因之间的同源性为94.3%,与参考毒株ACKJX2448的同源性最高,为95.6%~98.5%,与中国流行的H9N2代表株和疫苗株同源性较低。HA蛋白333-340位裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有低致病性禽流感病毒分子特征,受体结合位点均发生E198T和Q234L的突变,具有人样受体结合特征,在29、141、298、305、313、492位氨基酸有6个糖基化位点。ACKYN12019和ACKYN72019 NA基因同源性为93.6%,与Y280-like代表毒株的同源性分别为97.1%~97.5%和93.7%~94.6%,NA蛋白缺失63、64、65位氨基酸,在44、69、86、146、200、234位氨基酸处存在6个潜在的糖基化位点,NA蛋白红细胞结合（HB）位点分析发现,368-369、399-403、432位氨基酸处存在变异。研究结果显示,H9N2亚型禽流感病毒一直处于不断的变异之中,故应加强其监测与防控。