猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建与鉴定

(目的)构建猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)E基因真核表达载体pCI-E,为探讨E基因的功能奠定基础。(方法)根据GenBank上已发表的PEDV CV777株序列,利用Primer5.0设计1对两端含限制性核酸内切酶EcoR I和Sal I酶切位点的特异引物,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出完整的231bp的目的基因,将目的基因与pMD19-T载体连接转化到大肠杆菌DH5α中,用测序、PCR、双酶切鉴定阳性克隆体。然后将纯化后的E基因插入表达载体(pCI-neo)上,并经双酶切、测序鉴定。(结果)成功构建了PEDV的pCI-E重组真核表达载体。(结论)pCI-E重组真核表达载体的构建为进一步探讨PEDV E基因的功能和分子生物学特性及PED防御新途径提供依据。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-1株的分离与基因7的克隆分析

从四川某猪场采集疑似病例的腹泻粪样中分离到1株病毒,该病毒经过ST细胞传代培养盲传至第4代时出现病变。通过荧光抗体染色、病毒中和试验、TCID50试验、核酸类型鉴定,结合样品正染后在电镜下的观察结果,确定该毒株为猪传染性胃肠炎病毒,命名为TGEV SC-1株。参照GenBank中收录的TGEV基因7的序列设计了1对特异性引物,以SC-1株的细胞增殖毒的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得了大小约为303 bp的基因片段,包括完整的基因7序列片段（237 bp）,在GenBank上的登录号为DQ437507。核苷酸和推导的氨基酸序列比较分析结果表明,该毒株与其他毒株的同源性均在92.4%以上,TGEV SC-1株与美国的PURDUE和中国的TH-98毒株亲缘关系最近;与日本各分离毒株、中国TS株、美国Miller株、中国台湾TFI株和英国96-1933株的同源性较低。TGEV基因7在密码子使用的选择上,存在较大的偏向性;基因7编码蛋白在两端存在有明显的疏水性区域,在2～24和56～75位氨基酸残基处存在跨膜结构。     

人氨基肽酶N在猪丁型冠状病毒感染HEK293细胞中的作用

以HEK293细胞为模型,探讨人氨基肽酶 N(human aminopeptidase N,hAPN)在猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)入侵人源细胞中的作用。RT-qPCR/RT-PCR鉴定PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况,再用CRISPR/Cas9技术构建敲除hAPN基因的HEK293细胞系,通过CCK-8试验验证敲除细胞和野生型细胞的细胞活性;用RT-qPCR和Western blot检测hAPN敲除和过表达对PDCoV复制的影响;进一步通过同源建模和分子对接预测PDCoV S蛋白和hAPN蛋白的结合位点。结果显示： PDCoV在感染HEK293细胞后12~36 h快速增殖,在36 h达到顶峰,在HEK293细胞上至少可传至2代;hAPN敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无明显差异,细胞敲除hAPN可显著抑制PDCoV复制,细胞过表达hAPN可促进PDCoV复制;同源建模和分子对接表明,S1蛋白可与hAPN蛋白结构域II结合,主要是S1蛋白的受体结合基序1(receptor binding motif 1,RBM1)氨基酸残基TYR⁹²、THR⁵¹、THR⁴⁸、PHE¹⁶和MET¹⁴通过氢键与hAPN蛋白的氨基酸残基PHE⁴⁹⁰、GLN⁵³¹、ARG⁵²⁸和SER⁵²⁹结合。hAPN在PDCoV感染人源细胞中发挥重要作用,为深入研究PDCoV的细胞入侵和跨种传播机制提供了新的理论依据。     

猪丹毒疫苗的研究进展?

猪丹毒是由红斑丹毒丝菌引起的一种急性、热性传染病,广泛分布于世界各地,是危害世界养猪业的重要传染病之一.猪丹毒的隐性感染可能会发展成慢性型,成为猪丹毒的防治的难题.目前,免疫接种仍是预防猪丹毒最有效的方法,主要使用传统疫苗,随着分子生物技术的快速发展,新型疫苗的研究也应运而生,现对猪丹毒传统疫苗的使用和新型疫苗的研究近况进行阐述.     

某规模化猪场猪瘟、蓝耳病及伪狂犬病抗体检测与分析

为应用酶联免疫分析(ELISA)试剂盒,分别对某规模化猪场送检的70份血清进行猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体、猪伪狂犬病病毒g B抗体检测和猪伪狂犬病病毒g E抗体检测。结果显示,上述4种试剂盒检测,阳性率分别为72.9%、90%、58.6%和1.4%。据此对该猪场免疫状况进行了分析。     

大肠埃希菌外膜囊泡递呈猪瘟病毒E2蛋白的表达及其免疫效果评价

为探讨大肠埃希菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)作为猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白的递呈载体所产生的免疫效应,将切除跨膜区后的CSFV E2基因连接到pBAD18-Cm-ClyA的C-端,转化E.coli DH5α,用0.2%阿拉伯糖诱导表达后,收集含E2蛋白的OMVs免疫家兔。免疫印迹表明,该OMVs可特异性地与组氨酸标签单抗结合。间接ELISA结果表明,重组OMVs可诱导兔体产生高水平的IgG抗体。免疫后的家兔能很好地防御高剂量CSFV活疫苗攻击。说明大肠埃希菌OMVs递呈CSFV E2蛋白具有较好的免疫原性,为研究OMVs递呈CSFV E2蛋白疫苗奠定了基础。     

四川宜宾地区规模猪场腹泻仔猪大肠杆菌耐药性监测及血清型鉴定

为有效监测四川宜宾地区规模化猪场仔猪大肠杆菌耐药性及优势血清型变化,对采自该地区腹泻仔猪的38株大肠杆菌进行药物敏感性检测和O抗原血清型鉴定。结果表明,菌株对14种药物存在不同程度的耐药性,其中对氨苄西林、林可霉素、四环素和磺胺嘧啶极度耐药,耐药率分别为100%、100%、92.11%、89.47%;敏感性最高的是庆大霉素,敏感率为68.42%,氧氟沙星、丁胺卡那、环丙沙星和氟苯尼考相对比较敏感;所有菌株至少对4种药物耐受(4耐),最高达14耐。通过血清型鉴定,确定了15种血清型,共27株大肠杆菌,其中以O60、O101和O8为优势血清型。     

手术治愈母猪子宫角捻转

子宫捻转属于产道性难产之一。此病常见于牛、羊,马、猪则较少发生,猪子宫角一侧同时发生两处捻转,还未见报道。1992年4月1日,笔者通过阴道检查和剖腹探诊发现一例子宫角两处捻转并通过手术治疗,获得痊愈。现整理报道如下:     

霉菌毒素对猪生殖的影响

霉菌毒素是由霉菌或真菌产生的无色、无臭、无味的有毒害作用的次级代谢产物,主要由霉变的饲料、谷物所产生。猪场,特别是卫生条件相对较差的猪场普遍都受到霉菌毒素的影响,从而引发猪产生疾病,表现出一系列的临床中毒症状,对猪的繁殖影响较大,引起严重的经济损失。文中主要综述常见的霉菌毒素对猪生殖的影响,以及简单的防治措施。     

猪腹泻病毒病概述

猪腹泻性疾病在集约化养猪生产中十分普遍,对仔猪的危害巨大,也是导致哺乳及断奶仔猪发病和死亡的重要原因.病因主要有细菌性、病毒性、寄生虫性及普通内科疾病等.近几年来,病毒性疾病危害严重威胁我国的猪业生产,是影响和助推猪价的重要因素. 狭义的猪病毒性腹泻是指轮状病毒病、流行性腹泻、传染性胃肠炎3种;广义的病毒性腹泻是指在临床上出现腹泻症状的病毒病,其病原可延展为猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒.猪瘟病毒引起的腹泻常为急性型猪瘟,粪便带有特殊的恶臭味,易于区别;猪伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的腹泻常好发于仔猪,且呈顽固性腹泻症状.