猪卵母细胞冷冻损伤的研究进展

卵母细胞冷冻保存技术的发展为体外受精、核移植以及转基因动物生产等胚胎工程技术提供了极大的灵活性,同时为家畜保种及珍稀濒危动物的保护提供了新的技术途径。在此,综述了以猪为主的家畜卵母细胞的冷冻保存的原理及冷冻保存对卵母细胞超微结构和发育潜力的影响,以期为猪卵母细胞的冷冻保存研究提供一定的理论参考,从而提高猪卵母细胞冷冻后的成活率和体外受精生产效率。     

林麝生殖生理和繁殖性能观察研究

在上海新杨养麝实验场,对1998～2003年饲养繁殖的林麝进行繁殖生理和繁殖性能的观察研究。结果表明,人工饲养条件下,林麝15～18月龄可达性成熟,性成熟时体重5～6kg,雌性性成熟比雄性早1～2个月;30～36月龄时可达体成熟,成龄林麝体重7～8kg。雌雄林麝繁殖特点均具有明显季节性,每年9月下旬开始发情,至次年3月下旬后逐渐进入休情期,雄林麝繁殖季节略早于雌林麝;雌林麝1个发情周期为18～23d,发情持续期32～48h,1年1胎,每胎1～3仔,妊娠期为178～183d,饲养林麝年平均繁殖率为152.05%,年断乳仔麝平均成活率为74.04%。     

人乳铁蛋白对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

为了研究人乳铁蛋白对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用及其对细胞凋亡、p53蛋白表达和Caspase-3活性的影响,试验采用MTT方法检测细胞的生长抑制率、DNA片段化试验检测细胞凋亡、流式细胞术测定细胞周期、Western-blot检测p53蛋白表达、Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3的活性.结果表明:人乳铁蛋白对宫颈癌Hela细胞的抑制呈现时间和剂量依赖性,有73%的Hela细胞停滞在G0～G1期;Western-blot检测结果显示人乳铁蛋白可以上调p53蛋白的表达; 人乳铁蛋白作用48 h后Caspase-3的活性是0小时时的5.5倍,二者差异极显著(P<0.01).结果说明人乳铁蛋白能显著抑制宫颈癌Hela细胞生长,其抗肿瘤机制与诱导细胞凋亡、调控细胞周期、上调p53表达、活化Caspase-3有关.     

成年兔睾丸支持细胞的分离纯化研究

本试验以5月龄公兔为试验动物,去除睾丸被膜及血管,分离出完整的曲精细管后用0．5％胰蛋白酶和0．1％胶原酶消化并进行低渗处理,将制成的细胞悬液植入25cm^2的培养瓶,于38．7℃、5％CO2条件下培养,结果表明：经1：3Hanks超纯水低渗处理后,离体支持细胞纯度和活率分别达到72．04％和84．5％,显著提高了离体支持细胞的获取量和活率。     

重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定

[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取人胎肝总RNA,应用RT-PCR方法以自行设计的带有His标签的引物来扩增NGF"β基因;将所扩增的NGF"β基因经酶切、纯化,与IRES-EGFP片段共同插入到Pshuttle-cmv载体中,测序后,利用基因同源重组技术构建hNGF基因的复制缺陷型腺病毒载体AdNGF"β,经鉴定,转染HEK293细胞,观察EGFP表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。[结果]克隆的hNGF基因序列与GenBank中的hNGF基因序列完全一致并在3′端携带上His标签;重组腺病毒载体AdNGF-β经PacⅠ酶切得到大于23.0和4.5或2.9kb大小的2个片段,表明同源重组成功。2种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞后,均可观察到绿色荧光蛋白。收获病毒并测定感染滴度分别为1.00×109和0.99×109pfu/ml。[结论]克隆了带有His标签的hNGF"β基因,并成功构建了重组腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤研究奠定基础。     

转基因羊乳中重组人乳铁蛋白的分离工艺研究

人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)是一种隶属于铁结合蛋白家族的糖基化蛋白,具有多种生理功能.随着生物技术的发展,利用转基因技术在动物乳腺中生产重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF)已成为可能,目前已在鼠、兔、羊、牛等动物乳汁中成功地表达了重组人乳铁蛋白.     

Dmrt7基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

为了研究Dmrt7基因与GFP基因复制缺陷型腺病毒载体的构建,试验将购得的pReceiver-M01-Dmrt7质粒酶切、纯化后,与IRES-EGFP片段共同插到pShuttle-CMV载体中,经测序验证后,利用Adeasy-1系统细菌内同源重组原理构建Dmrt7基因的复制缺陷型腺病毒载体Ad-Dmrt7,再经PmeⅠ酶切线性化,转染HEK293细胞,观察GFP表达并检测重组腺病毒的效价。结果表明:重组腺病毒载体Ad-Dmrt7经PacⅠ酶切得到23 kb和2.9 kb 2个特异性片段,表明同源重组成功;将此种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞24 h后,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,表明Dmrt7重组腺病毒包装成功,效价为0.95×108pfu/mL。     

山羊与绵羊的染色体核型比较

采用外周血淋巴细胞培养法 ,对关中奶山羊和同羊的染色体核型进行分析。结果表明 ,关中奶山羊染色体数 2 n=60 ,其中有 2 9对常染色体和 1对性染色体 ,常染色体都为端部着丝点染色体。X染色体为第二对最大的端部着丝点染色体 ,Y染色体为唯一的、最小的中部着丝点染色体。同羊二倍体染色体数 2 n=5 4,其中包括 2 6对常染色体和 1对性染色体 ,常染色体中有 3对为中着丝点染色体 ,2 3对为端着丝点染色体 ,X染色体为最大的近端着丝点染色体 ,Y染色体为最小的亚中着丝点染色体     

一种构建全长cDNA文库的方法

建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析.     

家兔睾丸间质细胞的分离纯化及原代培养

为了研究家兔睾丸间质细胞(Leydigcell,LC)的分离纯化程序及体外生长特点,试验采用4种不同消化程序对家兔睾丸组织进行消化,percoll梯度分离出兔LC,并进行体外培养。结果表明:经4℃保存和34℃孵育,0.5mg/mLⅠ型胶原酶消化40min获得的细胞数最多,经percoll梯度分离的细胞纯度达92%;34℃、5%CO2条件下细胞生长良好,呈现梭形和不规则形2种形状。