版纳微型猪近交系雄激素受体AR基因的克隆和表达分析

为探讨猪雄激素受体(Androgen receptor,AR)基因的序列、结构、表达和功能,以版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)睾丸组织为材料,用RT-PCR技术获得猪AR基因cDNA序列,进行生物信息学分析,应用荧光定量技术明确其mRNA的多组织表达特征。结果表明:BMI AR基因cDNA长3 257bp(GenBank登录号:KU705631),包含2 688bp的全长编码区,位于猪X染色体,含有9个外显子和8个内含子;推导出的BMI AR蛋白含有1个核定位信号、1个DBD结构域和1个LBD结构域,无信号肽,无跨膜螺旋;与黄牛、山羊、人、猩猩、大鼠和小鼠的AR蛋白依次有94.2%、94.0%、90.2%、89.0%、88.1%和87.5%的同源性;其二级结构中以无规则卷曲和α螺旋为主,延伸链和β转角只在局部出现;在二级结构预测结果的基础上利用同源建模构建了其三级结构;AR基因mRNA在被检测的BMI 15个组织中呈现差异表达现象,表达量最高的组织为睾丸。该研究结果为进一步研究AR基因在BMI中的生理功能及调节机制提供了依据。     

版纳微型猪近交系ARRDC5基因亚细胞定位研究

【目的】抑制蛋白5 (ARRDC5)的功能尚不清楚,前期发现其可能与公猪繁殖力有关,本研究旨在克隆猪ARRDC5基因以及确定猪ARRDC5蛋白的亚细胞定位。【方法】通过NCBI下载猪近缘物种ARRDC5基因序列,在线BLAST比对获得猪EST序列,电子克隆猪ARRDC5基因编码区及部分侧翼序列。构建真核融合表达载体并瞬时转染猪睾丸细胞系ST,利用倒置荧光显微镜检测蛋白表达。【结果】获得版纳微型猪近交系(BMI) ARRDC5基因的c DNA序列1 045 bp,包含1 014 bp的CDS区,编码337个氨基酸,与牛及人的同源性高。成功构建了表达载体pEGFP-C1-ARRDC5,ARRDC5蛋白主要定位于细胞质中,部分细胞核中也有分布。【结论】研究结果为进一步研究该蛋白功能奠定基础。     

文山山地乌骨鸡微卫星DNA多态性分析

 利用位于家鸡24条染色体上的33个微卫星标记对云南文山山地乌骨鸡50个个体进行了遗传多样性检测。共检测到118个等位基因,每个座位等位基因数目从2到9个不等,平均等位基因数为3.5758±1.5619,有效等位基因数在1.4274~6.1250之间,平均为2.9750±1.1389;群体平均表观杂合度、期望杂合度及平均多态信息含量分别为0.8927±0.2172,0.6214±0.1259和0.5447±0.1528。研究结果表明：文山山地乌骨鸡群体内存在丰富的遗传多样性。     

版纳微型猪近交系CMAH基因克隆及亚细胞定位研究

胞苷磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)在免疫应答、炎症及肿瘤转移过程中起着重要的作用。前期发现其在版纳微型猪近交系(BMI)颌下腺、脾脏和舌下腺中高表达,且均显著高于其他组织,提示该基因可能在免疫排斥反应中发挥作用。本研究通过前期已成功扩增并且确定的编码区序列,设计带有酶切位点的引物并进行克隆,酶切连接法构建其真核表达载体,通过脂质体法转染猪肾上皮细胞系PK15,通过倒置荧光显微镜检测蛋白表达情况。获得BMI CMAH基因的包含有酶切位点的CDS序列1 746 bp,并且成功构建真核表达载体pEGFP-C1-CMAH。结果表明,该基因编码蛋白主要定位于PK15细胞的细胞质中,部分细胞核中也有表达。上述结果为进一步研究该基因编码蛋白的功能奠定了基础。     

牛科物种FSHβ基因外显子1和外显子2遗传特征分析

 促卵泡素（follicle stimulating hormone, FSH）对刺激动物卵泡发育和促进精子生成具有重要作用,但有关牛科物种FSH基因的群体遗传特征还不十分清楚。本文针对FSHβ基因外显子1和外显子2,采用PCR SSCP结合PCR产物直接测序技术对353头水牛(来自11个水牛群体)、30头牦牛和30头大额牛样品进行了群体变异检测,并结合NCBI数据库中已发表的普通牛、山羊和绵羊等物种同源序列进行了群体遗传和生物信息学分析。在FSHβ基因外显子1中,水牛中发现1个核苷酸替换和1个缺失,即c-49A>G和c-31delG;其中,SNP49在河流型和沼泽型水牛中均存在,等位基因c-49A为优势等位基因,而c-31delG只存在于沼泽型水牛中,且为杂合状态,基因频率为0.077。在牦牛外显子1中检测到c-37G>A和c-12T>C替换,且为连锁遗传的,而在大额牛外显子1中未检测到SNP位点。在FSHβ基因外显子2中,水牛中发现c132G>A替换,该位点在河流型和沼泽型水牛均存在,但等位基因频率在两类水牛间不一致。在牦牛外显子2中检测到c9C>T和c21C>T替换,该替换也存在于普通牛中;大额牛外显子2为单态,未见SNP位点。生物信息学分析显示,在一些牛科物种FSHβ基因外显子2中发现的SNP位点均为同义替换,揭示了其序列的高度保守性。在牛科物种中,山羊和绵羊FSHβ基因第36位密码子编码氨基酸与其他物种不同,可作为区分它们的遗传标记。     

猪睾丸表达序列37 (TEX37)克隆、mRNA表达及蛋白质功能生物信息学分析

目的以版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line, BMI)为材料,初步探索猪睾丸表达序列37 (TEX37) 基因的特性和功能,为该基因在猪精子生成过程的作用研究奠定基础。方法利用Oligo7软件设计特异引物扩增BMI TEX37基因整个编码区,应用实时荧光定量PCR技术检测BMI 15个组织的TEX37 mRNA表达谱,并初步预测TEX37蛋白质的功能,最后构建TEX37的多物种氨基酸系统进化树。结果扩增得到BMI TEX37编码区序列长561 bp,编码186个氨基酸,基因登录号KU705619,氨基酸登录号AOC89037。多组织相对荧光定量表达分析表明：TEX37基因在睾丸中呈相对最高表达,在其他组织中呈相对较低表达。生物信息学分析表明：TEX37蛋白质含有TSC21结构域,二级结构以无规则卷曲为主,N末端疏水,C末端亲水,有2类磷酸化位点,无跨膜螺旋结构和信号肽。系统聚类表明：BMI与其他物种相似度在67%以上,进化较保守。结论该研究可为TEX37基因在猪精子生成方面的作用机理研究提供参考。     

版纳斗鸡群体遗传多样性研究

 版纳斗鸡是我国著名的斗鸡品种之一。利用33个鸡微卫星标记对版纳斗鸡群体的47个个体进行了分子水平上的遗传多样性分析，共检测出123条多态性片段，每个微卫星座位上的观察等位基因数在2～6之间，平均每个微卫星座位上的等位基因数和有效等位基因数分别为3.7个和2.95个。群体平均杂合度为0.619 4，平均多态信息含量为0.553 3。33个微卫星座位有10个为中度多态座位，其它23个属于高度多态座位。结果表明：版纳斗鸡是一个遗传变异丰富的群体，有较大的选育潜力。     

沼泽型与河流型水牛Y染色体性别决定基因（SRY）编码区序列的比较分析*

 采用PCR产物直接测序技术对56头沼泽型水牛和26头河流型水牛Y染色体性别决定基因（SRY）的完整编码区及部分侧翼区序列进行了测定和比较分析,结果显示所有沼泽型水牛的SRY基因编码序列一致,所有河流型水牛的SRY基因编码序列也一致;但沼泽型水牛和河流型水牛之间SRY基因编码区序列相比在c.202位点存在一个G＞C替换,这个碱基差异属于错义突变,导致了pG68R,即编码的第68位氨基酸在沼泽型水牛为甘氨酸G,而在河流型水牛为精氨酸R;经群体检测确定SRY基因c.202G＞C变异为沼泽型水牛和河流型水牛之间普遍存在的现象,而其他牛科物种在此位置不存在差异。本研究使用的PCR引物可以作为水牛性别鉴定的特异性引物,而发现的差异位点也可以作为区分沼泽型与河流型水牛和水牛群体雄性介导基因流检测的分子标记。     

版纳微型猪近交系RNF4基因克隆、多组织qPCR表达及功能生物信息学分析

目的以版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line, BMI)为材料,初步研究STRA8基因的功能,为该基因在猪精子形成过程的作用研究奠定基础。方法以GenBank下载的猪STRA8基因序列JQ965783及多条猪EST序列为参考序列,设计特异性引物扩增版纳微型猪近交系(BMI) STRA8基因。对STRA8蛋白质进行理化特性和功能生物信息学分析,包括二级结构、蛋白功能域、疏水性、跨膜结构、信号肽、亚细胞定位、磷酸化位点以及蛋白质功能分析;搜索并下载其他物种的STRA8蛋白质序列构建多物种系统进化树。应用实时荧光定量PCR技术检测BMI STRA8在版纳微型猪近交系15个组织中的mRNA转录表达水平。结果获得了包含编码序列1 101 bp的全长序列1 316 bp,编码366个氨基酸,序列已提交GenBank,基因登录号KU705622,蛋白质分子量(Mw) 41.06 ku,等电点(pI) 4.52。STRA8二级结构中α螺旋含量最高,占52.19%;含有1个蛋白功能域;在氨基端有1个HLH结构域和1个卷曲螺旋区域,在羧基端有2个低复杂度区域;疏水性结果表明STRA8基因N末端、C末端均亲水;无跨膜结构,无信号肽序列;该蛋白质位于细胞核中的概率是56.5%;STRA8蛋白共有34个磷酸化位点;系统进化结果表明：BMI与羊、水牛的相似度最高。STRA8基因mRNA在检测的BMI 15个组织中呈现差异表达现象,睾丸中表达量最高。结论结果将为进一步研究STRA8基因在猪精子发生方面的作用及功能提供参考。     

版纳微型猪近交系B4GALNT2基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析

【目的】研究异种器官移植免疫排斥相关基因B4GALNT2的亚细胞定位情况。【方法】以版纳微型猪近交系(BMI)为试验对象,通过RT-PCR方法获得B4GALNT2基因cDNA序列,运用分子克隆技术构建B4GALNT2和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,将其转染猪肾上皮细胞PK15进行瞬时表达,同时用Mito Tracker和Hoechst33342荧光染料分别对线粒体和细胞核染色,通过EGFP示踪检测B4GALNT2在PK15细胞中的表达和定位。【结果】成功构建了BMI B4GALNT2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,转染PK15细胞后主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白的表达,试验结果与PSORTⅡserver网站的预测一致。【结论】B4GALNT2蛋白主要定位于细胞质,揭示该蛋白主要在细胞质中发挥其功能作用。