禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的克隆表达及抗原性鉴定

为了对禽多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白H(Omp H)的免疫学活性进行鉴定,本研究根据已发表的多杀性巴氏杆菌X-73株(U50907.1)设计了两对引物,用PCR方法扩增了禽多杀性巴氏杆菌CVCC44801株的Omp H,扩增片段为1 348bp(ORF为1 056bp)。扩增的Omp H与GenBank中登录号为AE004439.1(Pm70株)、EF635422.1(C44-1株)、EU016232.1(P52株)、JQ082510.1(XJ121株)、U50907.1(X-73株)、U52200.1(P-1059株)的序列比对分析结果表明,其核苷酸同源性范围在80.2%~98.4%,氨基酸同源性范围在79.6%~98.5%。扩增了去信号肽的Omp H基因,构建原核重组表达质粒pET-Omp H,转化BL21并诱导表达,SDS-PAGE结果表明,表达蛋白约为56ku,与预期分子量的大小相符;蛋白免疫印迹试验结果表明,该蛋白具有良好的免疫学活性,为建立禽Pm血清学检测方法以及禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗的研究奠定了基础。     

同时检测水禽3种常见病原菌的环介导间接PCR方法的建立

为建立同时检测大肠杆菌、禽源多杀性巴氏杆菌和鸭疫里默氏菌等水禽常见病原菌的环介导间接PCR方法,根据大肠杆菌的gapA基因、禽源多杀性巴氏杆菌的KMT1基因、鸭疫里默氏菌的OmpA基因序列,分别设计引物、标记于猪线粒体基因片段的两端,制备不同细菌的捕获探针;将捕获探针与待检测菌的基因组杂交、补平缺口、环化。采用1对引物反向扩增捕获探针,建立检测水禽3种常见病原菌的环介导间接PCR方法,扩增片段大小分别为328,422和504bp。沙门菌、金黄色葡萄球菌、小鹅瘟病毒的检测结果为阴性。该方法能检测出100pg的细菌基因组DNA,与常规PCR的符合性为100%。该方法可用于水禽3种常见病原菌的同时检测,是一种特异性好、灵敏度高的快速病原学诊断方法。     

多重基因重组型HH9N2亚型AIV福建分离株全基因组的分子特征

为从分子水平上了解福建省活禽市场H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化情况及其与其他亚型禽流感病毒之间的遗传进化关系,对2015年分离自福州市某活禽市场的一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Fujian/05/2015(H9N2)进行了全基因组扩增、克隆、测序,并对所获得的全序列与参考株进行了8个基因片段的同源性比较和遗传进化分析。结果显示:该分离株的HA基因与鸡源病毒A/chicken/Zhejiang/SIC40/2015(H9N2)的核苷酸同源性最高,裂解位点处氨基酸序列为-PSRSSR↓GLF-,符合低致病性裂解位点序列特征,其226位氨基酸为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2~6受体结合的特性;NA基因颈部63、64和65位点氨基酸有缺失,与鸡源病毒A/chicken/Zhejiang/SIC32/2014(H9N2)的核苷酸同源性最高;M2基因的31位氨基酸为N,表明该病毒已经对金刚烷胺类药物产生耐药性;分离株的基因组由3个亚系的基因重组产生,其中HA和NA基因来源于BJ/94亚系,PB2和M基因来源于G1亚系,PB1、PA、NP和NS基因来源于F98亚系;该分离株的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS与H7N9、H10N8、H5N6亚型禽流感病毒的内部基因存在复杂的交叉重组现象。因此需加强对H9N2亚型禽流感病毒的流行病学监测。     

致蛋鸡输卵管炎的大肠杆菌分离及特性分析

2015年从福建省某蛋鸡场病死鸡的肝脏分离到一株细菌,命名FQ-180。为进一步了解其生物学特性,经革兰氏染色、电镜检测等方法初步鉴定为大肠杆菌;分离株O血清型鉴定分属于O78型;药敏试验结果表明菌株FQ-180仅对阿莫西林、氟苯尼考、头孢氨苄、头孢唑啉高度敏感。采用PCR法对分离株16S r DNA基因序列进行了扩增,扩增出长度为1470 bp左右特异性目的片段,进一步鉴定为大肠杆菌。     

鸭腺病毒A型Hexon基因克隆与序列分析

为明确鸭腺病毒A型Hexon基因特征及其在腺病毒科病毒分类中的作用,本研究从前期分离鉴定的一株番鸭源鸭腺病毒A型分离株（JX2016株）中分段扩增获得其Hexon基因编码区。结果发现,鸭腺病毒A型JX2016株Hexon基因编码区为2 733 bp,编码910个氨基酸,与鸭腺病毒A型（FJ12025株）核苷酸同源性最高,达99.8%;与其他分离株Hexon基因核苷酸同源性均在99.4%以上;与鸭腺病毒2型（GR株,未明确分类地位）同源性仅为54.5%;与禽腺病毒A型Phelps株（鸡源）及P29株（鹅源）的核苷酸同源性分别为53.6%和55.2%。遗传进化树分析发现,所有鸭腺病毒A型分离株在遗传进化上均处于相同的亚分支,且与绵羊腺病毒D型（OAV287株）均处于富AT腺病毒属遗传进化分支。但鸭腺病毒2型（GR株）与禽腺病毒A型Phelps株（鸡源）、P29株（鹅源）却处于同一遗传进化分支,均属于禽腺病毒属遗传进化分支。基于Hexon蛋白的遗传进化分析,建议将鸭腺病毒A型重新命名为鸭源富AT腺病毒A型,将鸭腺病毒2型重新命名为鸭源禽腺病毒。     

鸭瘟病毒新近分离毒株部分基因变异分析

旨在研究鸭群中新流行的鸭瘟病毒(duck plaque virus,DPV)感染状况及其分子特征。本研究对2016—2017年福建不同地区疑似感染DPV的发病鸭组织样品进行了检测、病毒分离和部分基因的序列分析。从临床样品中分离获得24株DPV,发现确诊感染DPV鸭的日龄存在品种差异性,其中半番鸭和番鸭感染DPV的日龄中位值分别为90和88d,而麻鸭感染DPV的日龄中位值为287d。对DPVUL56/LORF5基因、TK/gH基因及UL2区域的序列分析表明,分离毒株均未出现基因片段缺失,与我国DPV参考强毒株的序列相似性均在99%以上,但在UL56/LORF5基因及TK基因上存在有规律性的核苷酸变异。经分子系统进化分析发现,新近流行的DPV毒株与我国参考强毒株(GroupⅠ)处于不同进化分支,为GroupⅡ进化分支,且可进一步细分为两个不同的亚分支(GroupⅡa、GroupⅡb)。以上结果揭示,新近流行的DPV毒株感染不同品种鸭存在日龄差异性,与我国DPV参考强毒株相比已出现不同程度的变异,应加强对该病毒的分子流行病学监测,实时了解其流行变异情况,为新流行鸭瘟的快速准确诊断和防控提供科学依据。     

鸭坦布苏病毒感染对鸭免疫器官指数和体液免疫的影响

鸭坦布苏病毒是近年来在我国发现的可引起种（蛋）鸭高热、采食量和产蛋量骤降的新病毒。本研究以麻鸭为动物模型,测定麻鸭感染鸭坦布苏病毒后,其免疫器官指数、重组H5亚型禽流感病毒灭活疫苗和鸡新城疫病毒弱毒活疫苗诱导产生的抗体水平。结果表明,鸭坦布苏病毒感染会侵害麻鸭的免疫器官,第1～3d脾脏明显肿大,第7～10d试验组胸腺指数极显著低于对照组,第1～14d法氏囊出现萎缩;与仅免疫疫苗的对照组鸭相比,感染鸭坦布苏病毒后再注射疫苗的试验组鸭产生抗体的时间延迟、抗体的峰值降低,抗体下降加快,且在整个试验期内产生的抗体水平均低于对照组鸭的抗体水平,表明鸭坦布苏病毒感染可抑制鸭对灭活疫苗和弱毒疫苗的体液免疫应答能力。     

鸭坦布苏病毒感染对鸭T淋巴细胞转化功能的影响

以麻鸭为动物模型,测定鸭坦布苏病毒感染后鸭的T 淋巴细胞增殖转化能力.结果显示鸭坦布苏病毒感染的试验组鸭外周血淋巴细胞刺激指数呈先上升后下降再回升的趋势,其中于第3d试验组淋巴细胞刺激指数极显著高于对照组（P〈0.01）,于第5d下降至对照组水平,于第7、15d显著低于对照组（P〈0.05）,于第21d回升至接近对照组水平.以上结果表明,鸭坦布苏病毒感染鸭后7～21d会抑制鸭T 淋巴细胞的增殖转化功能,造成鸭T 淋巴细胞的免疫抑制.     

鸭RLRs和IFN基因SYBRGREENⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

首次建立以GAPDH为内参,同时检测鸭RIG-I、MDA5、IFN-α和IFN-γ等4种mRNA相对表达量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法(RT-FQ-PCR)。以目的基因的克隆质粒为标准品,建立标准曲线,并进行熔解曲线、重复性及稳定性分析。该方法 Ct值线性范围为12.0~32.0;目的基因(RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-γ)和内参基因(GAPDH)的扩增效率均在95%~105%,其相关系数均在0.99以上;扩增产物的熔解曲线都只出现1个特异性单峰,无引物二聚体或其他非特异性产物生成,RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-γ和GAPDH的Tm值依次为(81.9±0.33)、(81.9±0.32)、(93.6±0.23)、(81.8±0.28)、(87.8±0.24)℃,其敏感度均达到100copies·μL-1,重复性和稳定性好,为从mRNA水平上深入研究RIG-I样受体、干扰素与鸭机体免疫功能相关性奠定了基础。