黑麦草属种质资源遗传多样性研究

就国内外黑麦草属牧草的分类、分布情况、形态及解剖学特征和遗传多样性进行总结和探讨,以期为黑麦草属资源进一步研究提供借鉴与参考.     

菊苣EST-SSR分子标记开发及通用性分析

为了开发菊苣（Cichorium intybus）简单重复序列（Simple sequence repeat,SSR）分子标记,采用菊苣表达序列标签（Expressed sequence tags,EST）序列设计EST-SSR引物,并验证引物的有效性和通用性。结果表明：菊苣EST序列中共搜索到648个SSR位点,146种重复基序,SSR出现频率为1.61%;三核苷酸重复类型最多（46.45%）,TC/GA基序出现频率最高（14.35%）;152对EST-SSR引物在菊苣中的有效扩增率和多态率分别为78.29%和57.24%。其中37对引物在31份莴苣亚族（Lactucinae Less.）材料中的扩增转移率为86.05%,遗传多样性分析显示不同种间存在明显的遗传分化,聚类结果与材料的地理来源有较高相关性。综上所述,基于菊苣EST序列开发的SSR引物可用于菊苣及其近缘属种遗传多样性分析及种间鉴定,为菊苣族（Lactuceae Cass.）种质资源评价、系统进化研究及分子标记辅助育种奠定了重要基础。     

基于SSR分子标记的13个白三叶(Trifolium repens L.)品种指纹图谱构建

白三叶（Trifolium repens L.）是一种多年生冷季型豆科牧草,因其具有产量高、品质优良等特点,已成为我国西南地区重要的优质牧草。为分析国外引进的白三叶新品种的遗传多样性,本研究利用简单重复序列（Simple sequence repeats,SSR）分子标记对13个白三叶品种进行品种鉴定及DNA指纹图谱的构建,以期利用此方法直接、有效的鉴定和区分白三叶品种。结果表明：20对SSR引物共扩增出115条不同的条带,其中多态性条带104条（90.4%）;同时所有引物的多态信息含量（Polymorphism information content,PIC）范围为0.198~0.455,平均值为0.333;AMOVA分析表明,49%的遗传变异发生在品种间,51%发生在品种内部;聚类分析和主成分分析的结果表明,13个品种的亲缘关系中,'超级海法’和'海法’的亲缘关系最密切,'米莉格’和'克朗德’的遗传距离较远;利用6种具有代表性的引物gtrs1164,gtrs573,gtrs541,gtrs171,gtrs536和gtrs173构建的DNA指纹图谱具有较强的识别能力,可将13个白三叶品种有效的鉴定区别开来。综上所述,本试验所选用的6对引物具有良好的多态性,可用于白三叶品种的指纹图谱构建。     

非生物胁迫下多年生黑麦草qRT-PCR分析中内参基因的选择

提高实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)准确性的先决条件是选择表达稳定性较高的内参基因。本研究以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)为材料,利用q RT-PCR技术检测翻译起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4 alpha,e IF4A)、TNF结合蛋白Ⅰ(Tat binding protein-1,TBP-1)、泛素连接酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)、多聚泛素酶基因(ubiquitin,UBQ)、生物钟受体蛋白(zeitlupe,ZTL)和甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)6个候选内参基因在不同非生物胁迫下的表达情况。运用ge Norm(ver.3.5)、Normfinder(ver.0.953)、Best Keeper(ver.1.0)、Delta Ct和Ref Finder软件综合分析表明,在干旱、盐、热胁迫及ABA处理下,e IF4A基因表达稳定性最高;在涝胁迫下,UBQ基因表达稳定性最高。因此,e IF4A和UBQ候选基因可作为不同胁迫下的内参基因,为进一步开展多年生黑麦草基因表达的定量研究了提供了一定的理论依据。     

氮肥种类对多花黑麦草产量与品质的影响

为充分利用西南地区牧草资源,完善牧草营养施肥技术,本试验以‘长江2号’、‘特高’、‘F4N’3个品种多花黑麦草(Lolium multiflorum L.)为材料,研究不同氮肥种类对其产量和品质的影响。结果表明:施用尿素的多花黑麦草的株高和产量均为最高,其中尿素处理的多花黑麦草第2茬鲜草产量为7 023kg·hm~(-2),显著高于碳铵和硝基复合肥处理(P0.05);硝基复合肥处理的前3茬多花黑麦草的粗蛋白(CP)含量均最高,但施用尿素的多花黑麦草的蛋白质产量(2 054.10kg·hm~(-2))显著高于碳铵和硝基复合肥处理(P0.05);尿素处理前3茬多花黑麦草的中、酸性洗涤纤维(NDF、ADF)含量均显著低于碳铵和硝基复合肥处理(P0.05);施用尿素和碳铵的多花黑麦草粗脂肪(EE)含量差异不显著,但均显著高于硝基复合肥处理(P0.05)。碳铵处理的多花黑麦草的可溶性碳水化合物(WSC)含量显著高于硝基复合肥和尿素(P0.05),但硝基复合肥和尿素处理间差异不显著。因此从产量和品质综合考虑,3个品种多花黑麦草均以施用尿素较好。     

6份川西北短芒披碱草种质苗期的抗旱性综合评价

为了探明来自川西北的6份短芒披碱草(Elymus breviaristatus)种质材料的苗期抗旱性差异,采用室内盆栽法对种质进行为期21d的干旱处理,分别于停止浇水第0、7、14和21天取植株叶片,研究了不同水分胁迫条件下各种质的相对含水量(RWC)、相对电导率(REC)、脯氨酸(Pro)含量、叶绿素(Chl)含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性7个生理特征指标的变化,并采用隶属函数法对6份短芒披碱草种质材料的抗旱性进行综合评价。结果表明,干旱胁迫对不同抗旱短芒披碱草种质材料的各生理指标有显著的影响(P0.05),其各表型值与对照差异显著(P0.05),且各种质间差异显著(P0.05)。随着干旱胁迫时间的延长,6份短芒披碱草材料的相对含水量和叶绿素含量呈显著下降趋势(P0.05),而丙二醛含量、相对电导率、脯氨酸含量和POD活性表现出上升趋势,SOD活性呈现先上升后下降的趋势。由隶属函数分析7个生理指标得到供试材料苗期抗旱性强弱顺序依次为205176205133红10-5204290红6-5205104。     

鸭茅EST-SSR标记在4种禾草上的可转移性

为了检验鸭茅EST-SSR标记在几种禾本科植物上的可转移性并筛选出可应用于后续研究的引物,本研究用40对可在鸭茅(Dactylis glomerata)上扩增产物的鸭茅EST-SSR引物,分析了6份多花黑麦草(Lolium multiflorum)、6份高羊茅(Festuca arundinacea)、3份扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa)和3份牛鞭草(H.altissima)共18份材料的转移率、遗传多样性和亲缘关系。结果表明,多年生黑麦草和高羊茅可转移率为60%,扁穗牛鞭草和牛鞭草转移率最低,均为50%,26对引物共获得条带128条,多态性条带121条,多态性比(PPB)为94.53%,平均扩增出多态性条带4.92条,平均多态性信息量0.952。18份材料遗传相似系数范围为0.208~0.974,在遗传系数为0.68时,4个物种分别独自聚为一大类。本研究证实利用鸭茅EST序列开发的EST-SSR在有一定亲缘关系的物种间转移是可行的,可转移的引物对未来禾本科遗传育种研究有一定的参考价值。     

基于SSR标记的四倍体鸭茅遗传图谱加密

【目的】利用转录组测序开发的EST-SSR标记和鸭茅基因组调研测序开发的基因组SSR（genomic-SSR）标记,对已构建的四倍体鸭茅遗传图谱加密,为定位控制鸭茅重要农艺性状的QTL位点奠定基础。【方法】基于拟测交策略,以“楷模”（高杆、多分蘖、宽叶、早熟）和“01436”（矮秆、少分蘖、细叶、晚熟）作为亲本材料进行杂交,得到一个含有214株鸭茅材料的作图群体,利用亲本和随机选取的5个单株对574对EST-SSR标记和150对Genomic-SSR进行引物筛选,PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后,将扩增条带清晰、在亲本之间存在差异且子代间存在分离的多态性引物用于亲本及群体扩增。将扩增结果按标记类型统计分析,对于亲本间存在差异的条带,按条带有无（有带计1,无带记0）对DNA扩增产物按进行统计,经卡方检验,将分离比例符合1﹕1（亲本基因型为Aaaa×aaaa或aaaa×Aaaa）和3﹕1（亲本基因型为Aaaa×Aaaa）的标记,用于遗传连锁图谱构建。符合作图要求的标记采用HighMap软件进行遗传图谱构建。【结果】最终筛选出符合要求的EST-SSR引物31对和Genomic-SSR引物17对,引物多态性分别为5.4%和11.3%,总的多态性为6.6%。对鸭茅214个作图群体单株及亲本DNA进行扩增,共得到169个多态性位点,其中EST-SSR101个,Genomic-SSR68个位点。169个标记位点经卡方检验分析表明,有89个标记符合孟德尔分离规律,标记可用率为52.7%,其中呈Aaaa×aaaa或aaaa×Aaaa分离类型的标记有79个,呈Aaaa×Aaaa的有10个,其余80个为偏分离标记。将SSR标记整合以前的标记信息,重新构建了一张包含2 551个标记,覆盖7个连锁群,总长度为758.4 cM的鸭茅高密度遗传图谱。加密后的图谱包含SNP标记4 187个,SSR标记84个,各连锁群标记数在166-709个,每个连锁群的平均标记数为364个,LG1包含最多标记数有709个,LG7标记数最少166个,各连锁群长度在60.28-147.09 cM,标记平均密度为0.19-0.76 cM,总的平均图距由原来的0.37 cM缩至0.3 cM,且由于标记密度的改变,各连锁群上标记分布的位置也发生较大变动。【结论】增加了部分SSR标记后,新构建了一张包含2 551个标记,覆盖7个连锁群总长度为758.4 cM的四倍体鸭茅遗传图谱,总长度增加42.63 cM,平均图距由0.37 cM缩至为0.3 cM。     

优化ApoB抗原免疫剂量提高抗体产生的效果

以湖羊为研究对象,设计了3种不同的ApoB抗原免疫剂量,从抗体产生规律、抗体效价和ApoB产品性能三个方面进行了统计和分析。结果表明：组2(抗原剂量每次0.4 mg)的抗体效价显著高于组1(抗原剂量每次0.2 mg)和组3(抗原剂量每次1 mg),组2五免后的抗体效价能够达到1:29,而且ApoB的产品性能检测各个指标均合格。表明ApoB抗原每次免疫注射剂量为0.4 mg时,所生产的ApoB抗体效果最佳,为ApoB抗体广泛应用于医疗领域奠定基础。