隆林黑猪氨肽酶N基因的生物信息学分析和原核表达

本研究旨在进行猪氨肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因扩增和生物信息学分析,并在大肠杆菌中进行表达。从三元杂商品猪和广西地方猪隆林黑猪中扩增出pAPN基因,通过ExPASy和Mega 6.0等软件对其进行生物信息学和系统进化分析;将pAPN克隆到原核表达载体pET-32a（+）,构建重组质粒pET-32a-pAPN,使其在大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中表达。经IPTG诱导表达、纯化,产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果显示,隆林黑猪和三元杂商品猪的pAPN基因长2 949 bp,开放性阅读框为2 892 bp,编码963个氨基酸,同源性为100%,与GenBank数据库中公布的标准序列（登录号：NM_214277）相比,隆林黑猪共有5处氨基酸突变,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108Ile和Ser330Pro 4处突变位于pAPN酶催化活性区域,Val621Ile突变位于APN病毒结合区域。pAPN为不稳定的亲水性蛋白,跨膜区位于第17~33位氨基酸,有12个N-糖基化位点,33个B细胞抗原表位预测位点,三级结构为同源二聚体。Val621Ile突变可能影响APN结合病毒的能力。试验成功构建重组质粒pET-32a-pAPN,SDS-PAGE鉴定以包涵体形式表达,纯化后的蛋白在123 ku处有明显条带,且具有良好的抗原性,为进一步获得多克隆抗体、研究该基因和TGEV、PEDV、PDCoV的关系奠定基础。     

广西猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及gE基因序列分析

对广西5个发生疑似猪伪狂犬病疫情的规模猪场进行发病情况、临床症状和剖检病变观察,并采集病猪的脑、扁桃体、脾、淋巴结等作为病料进行PCR诊断、家兔接种试验、病毒的分离培养及gE基因的克隆与序列分析,确诊这5个猪场发生的是由伪狂犬病野毒引起的伪狂犬病疫情。对伪狂犬病病毒gE基因测序、核苷酸同源性及遗传进化分析表明,从桂林荔浦县、来宾象州县、贵港市分离到的编号分别为GX-LP、GX-LB、GX-GG的3个毒株,与国内分离株Ea、GDSH处于同一细小分支,遗传关系较近。从南宁武鸣县、玉林博白县分离到的编号分别为GX-WM、GX-BB的2个毒株,与国内近年分离到的毒株如BJ-RD、HB-HS、HB-LF、YY、ZM、MZ1、QBA株处在同一细小分支上的,遗传关系较近。5株伪狂犬病病毒分离株的gE基因均与国外分离株如Yangsan、NiA3、Nia-1、P-PrV、Rice、kaplan、Becker保持较远的遗传关系,明显处于不同的遗传分支上。     

塞内卡病毒广西分离株的初步分离与鉴定

为了确诊一例疑似SVA感染的临床病例,本试验将从广西地区某猪场母猪和肥育猪鼻及蹄部采集的出现典型水泡性病变的猪水泡液进行无菌处理后接种PK-15细胞,连续传代培养,通过细胞病变、RT-PCR扩增、基因序列测定、TCID50和间接免疫荧光等方法对分离得到的病毒进行鉴定.结果显示:该病毒株在PK-15细胞上生长良好,可见明...     

南方三省猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查研究

根据VR2332和CH-1aE基因序列设计一对特异性引物，对广西、广东、海南三省15个猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株E基因进行RT-PCR扩增，将扩增出的668bp片段插入pMD18-T载体中，进行序列测定。结果显示，15个毒株的E基因核苷酸序列之间的相似性为84．1％～100％，推导编码的氨基酸序列之间的相似性为81．1％～100％；与VR2332、CH-1a、LV株核苷酸之间的相似性分别为85．4％～98．5％、87．1％～96．2％、62．5％～63．8％，与VR2332、CH-1a、LV株氨基酸之间的相似性分别为83．1％～95．5％、86．1％～95．0％、51．7％～57．2％，表明15个毒株的E基因区域变异较大，均属美洲型。将15个流行毒株与国内外已发表的37株猪繁殖与呼吸综合征病毒相应序列进行比较，建立的遗传进化树表明这15个毒株分别属于3个亚群。推导编码氨基酸的比较结果表明，分别属于不同亚群的不同地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株在E基因编码蛋白的潜在糖基化位点数目、抗原表位区域和与毒力相关的氨基酸等均存在变异。     

PRRSV广西分离株GXYL-1403全基因克隆与序列分析

对本实验室所分离的1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株GXYL-1403进行全基因组克隆和序列分析。参考已发表的扩增全长PRRSV序列的13对特异性引物,用RT-PCR方法对病毒基因组进行分段扩增。将扩增得到的PCR片段克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。通过软件对所扩增序列进行拼接,获得GXYL-1403的全长序列,并对GXYL-1403进行比较和遗传进化分析。结果表明GXYL1403株基因序列全长为15 018bp,与国内外多株PRRSV毒株进行同源性比较发现,与VR-2332的相似性为89.1%,与TJ、JXA1、HEB1、HUB1、HUB2、TP株同源性达到了97.9%~98.1%。另外,GXYL-1403分离株nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特异的1+29个氨基酸的缺失。特别重要的是,在缺失29个氨基酸区域的上游,含有连续20个氨基酸缺失,在下游出现了连续74个氨基酸的缺失。遗传进化分析发现美洲型PRRSV主要分为3个亚群,GXYL-1403跟高致病性PRRSV毒株属于同一分支,证实了GXYL-1403株为美洲型PRRSV毒株。     

2016—2021年广西部分地区猪盖他病毒血清学回顾性调查

为了解近几年广西壮族自治区地区猪盖他病毒（GETV）的感染和流行情况。本研究从广西壮族自治区12个市区的61个猪场收集来自2016—2021年的猪血清样品574份,采用中和试验（NT）方法进行GETV血清流行病学调查。NT结果表明,阳性猪场26个,猪场阳性率为42.62%,有10个市区的129份血清为GETV中和抗体阳性,血清总体阳性率为22.47%,几何平均效价（GMT）为1∶141.76。百色市GETV中和抗体阳性率显著高于梧州市、来宾市、柳州市（P<0.05）,河池市、防城港市、玉林市、百色市阳性血清GMT显著高于钦州市、桂林市、梧州市、南宁市（P<0.05）;检测样品中2021年GETV中和抗体阳性率显著高于2016—2019年和2020年（P<0.05）,2016—2019年阳性血清GMT显著高于2020年和2021年（P<0.05）。选择NT法结果中GETV中和抗体阳性样品129份,阴性样品190份,用IFA法重新检测是否有GETV抗体,两种方法针对阳性和阴性结果的Kappa系数为0.746（μ=13.32,P<0.01）,一致性强度好。以上结...     

猪圆环和伪狂犬混合感染引起育肥猪肠炎和呼吸道疾病的诊断与分析

广西博白县某散养户猪场近期暴发疫情,主要表现在育肥猪发烧、咳嗽喘气、水样腹泻,使用多种抗生素治疗均无效。剖检发现猪全身淋巴结肿大,肺脏表面出现灰白色坏死灶;大肠臌气,肠壁变薄。经实验室检测最终确诊该病例为猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒混合感染。     

一例犬细小病毒病的病例报告

接诊一例因呕吐、腹泻前来就诊的患犬,通过全血细胞计数、C反应蛋白、血气分析、X射线检查、粪便检查、传染病检测,确诊为犬细小病毒病。经对因对症治疗,患犬康复出院。总结了该病例的诊断和治疗经过,以供参考。     

猫杯状病毒、猫细小病毒、猫流感病毒和猫疱疹病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为建立快速检测猫科动物重要传染病的多重PCR检测方法,根据GenBank中登录的猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)、猫细小病毒(feline parvovirus, FPV)、猫流感病毒(feline influenza virus, FIV)和猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus type 1,FHV-1)的相对高保守性基因ORF2、NSP1、M和UL27,分别设计4对特异性引物。通过对反应体系的摸索及优化,建立了可同时扩增FCV(257 bp)、FPV(380 bp)、FIV(519 bp)和FHV-1(761 bp)的四重PCR反应条件及体系。结果显示：能够在同一体系中用同一反应扩增出以上4种病毒基因,其重复性及特异性均良好,敏感性可达到10 copies/μL。用该方法检测69份口鼻拭子,结果发现FCV和FPV混合感染的阳性率为10.14%,FCV和FHV-1混合感染的阳性率为1.45%,FCV、FPV和FIV混合感染的阳性率为10.14%。结果表明：研究建立的四重PCR检测方法可对常见猫科动物病毒性传染病进行快速准确的鉴别诊断,而且为...