猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6核仁蛋白Fibrillarin的亚细胞定位分析

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与Vero E6细胞核仁fibrillarin蛋白的亚细胞定位的特征.本实验参照GenBank中人细胞fibrillarin基因(M59849.1)序列,设计并合成特异性引物,利用RT-PCR方法扩增了Vero E6细胞的fibrillarin基因,并将其克隆于真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed-Fib.将pDsRed-Fib与本实验室构建的含有PEDV N基因的重组质粒pAcGFP-N,共转染Vero E6细胞.Western blot结果表明fibrillarin及N融合蛋白在转染的Vero E6细胞中均获得表达;利用共聚焦显微镜观察显示在共转染Vero E6细胞中PEDV N蛋白与Vero E6细胞核仁中的fibrillarin发生共定位.该结果为进一步研究PEDV和核仁蛋白相互作用奠定基础.     

猪流行性腹泻疫苗的研究

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由尼多目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)α-冠状病毒中的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic d iarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种急性、高度传染性的肠道疾病,该病以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征.     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA(ds-cDNA),通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×10⁸ CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0 kb,平均长度约为1.1 kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。     

Vero E6细胞中B23.1基因的扩增及其原核表达

应用RT-PCR技术,利用含有酶切位点的上、下游引物扩增得到Vero E6细胞中编码B23.1蛋白的基因片段,并进行序列测定及分析,结果表明,B23.1基因含有一个长901 bp的开放阅读框(ORF),未发现碱基的插入和缺失。将其进行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,而后定向克隆到经相同双酶切的pGEX-6p-1载体中,构建的重组质粒命名为pGEX-6p-B23.1;将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达;SDS-PAGE结果表明,表达出与预期大小相符的约68 ku的重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式存在;Western blotting分析结果表明,表达的重组蛋白与B23蛋白单克隆抗体有很好的反应活性。     

向阳湖围垸沟渠生态修复工程设计研究

水生态文明建设已成为当今社会建设的基础内容,以湖北省咸宁市咸安区向阳湖围垸沟渠生态修复(一期)工程为例,系统整理了人工湿地和沟渠生态护岸设计思路,详细介绍了主要设计内容,同时对人工湿地的进出水水质达标可行性进行了量化分析。结果表明：工程主要生态修复措施为人工湿地,人工湿地设计水量为20000 m³/d,分为沉淀区和净化区,人工湿地BOD₅、TN和TP污染物需求去除量分别为30.24、4.32、0.79 t/a,按人工湿地污染物去除负荷分析BOD₅、TN和TP实际去除量分别为32.66、4.90、0.82 t/a,按水生植物对污染物的削减能力分析BOD₅、TN和TP实际去除量分别为44.33、5.36、1.08 t/a,无论是按人工湿地污染物去除负荷分析污染物去除量,或是按水生植物对污染物的削减量分析,人工湿地的水质达标可行性均能满足设计要求。     

猪丁型冠状病毒S1-CTD相互作用宿主蛋白的筛选和鉴定

猪丁型冠状病毒纤突蛋白S1亚基C端结合域(S1-CTD)是诱导中和抗体产生的主要区域,为研究与其相互作用的宿主蛋白,采用HEK-293T真核表达系统表达并纯化了S1-CTD,提取了猪回肠上皮细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀筛选了可能与S1-CTD相互作用的蛋白并进行质谱分析,发现32个疑似相互作用的宿主蛋白。构建其中可能与S1-CTD互作的蛋白KIF1 binding protein (KIFBP)的真核表达质粒,通过免疫共沉淀和激光共聚焦验证上述宿主蛋白与S1-CTD是否存在相互作用,结果表明KIFBP和S1-CTD之间存在相互作用,共同转染时在细胞质共定位。进一步研究表明,过表达KIFBP能够有效降低病毒RNA水平和病毒滴度,其中mRNA水平降低了约70%,病毒滴度降低了10^1.6TCID₅₀。综上,本研究筛选并鉴定出一种与PDCoV S1-CTD相互作用的宿主蛋白KIFBP,为了解PDCoV的致病机制提供了理论基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析

以猪流行性腹泻病毒（PEDV）可溶性的猪氨基肽酶N受体为靶蛋白对PEDV S1基因特异性肽库进行3轮生物淘选,然后对30个淘选的噬菌体克隆进行测序。序列分析发现,2个噬菌体克隆展示无义氨基酸序列,其余28个噬菌体克隆展示的氨基酸序列位于PEDV S蛋白的第249-529位氨基酸区域,这个区域被命名为MRR。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对MRR基因进行真核表达。Western blot结果表明,表达的MRR重组蛋白能够与兔抗PEDV多克隆抗体反应。     

猪传染性胃肠炎的综合防制

猪传染性胃肠炎(TGE)是由尼多目、冠状病毒科的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的猪的一种高度接触传染性的肠道疾病,以引起14日龄以内仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率(可高达100%)为特征。     

猪源大肠杆菌中氯霉素类药物耐药基因的检测与分析

氯霉素类药物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考等。此类药物抗菌谱广、吸收快、体内分布广泛,在兽医临床上发挥着举足轻重的作用,其耐药性也备受重视。因此,本试验对黑龙江省受试养殖场60株临床分离的猪源大肠杆菌的floR和cmlA基因进行分子检测和分析,旨在为猪源大肠杆菌氯霉素类药物耐药基因的研究和分子流行病学调查提供试验依据,对临床合理用药以及控制细菌耐药性发展均具有重要意义。     

抗猪SIgA SC片段单克隆抗体的制备及鉴定

为获得抗猪分泌型IgA(SIgA)的单克隆抗体(MAb),本研究以纯化的SIgA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIgA SC片段的杂交瘤细胞株,命名为2F9。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶200和1∶16 000。Western blot鉴定显示该MAb能够识别天然SIgA蛋白;IFA显示该MAb可以识别真核细胞表达的SIgA SC蛋白。抗猪SIgA SC片段的MAb制备,为建立一系列猪消化道病原的特异性SIgA诊断方法及研究黏膜免疫提供了重要工具,具有广阔的应用前景。