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221.
为鉴定BHK-21细胞中稳定表达猪白细胞介素-2(PoIL-2)的活性,本研究利用RT-PCR技术从猪的淋巴细胞中克隆PoIL-2基因,将其连接于pcDNA3.1载体中,并转染BHK-21细胞.经过G418筛选及RT-PCR鉴定,获得稳定表达PoIL-2基因的BHK-21细胞系.采用实时定量PCR及ELISA测定PoIL-2在BHK-21细胞内的表达,同时以淋巴细胞增殖试验(MTT)检测PoIL-2蛋白活性.试验结果表明稳定整合PoIL-2基因的BHK-21细胞系其PoIL-2 mRNA的转录效率是阴性对照组1.43倍,蛋白表达量是阴性对照组1.29倍.MTT试验表明真核表达的PoIL-2促淋巴细胞增殖活性与阴性对照组相比差异极显著(p<0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIL-2具有良好的生物学活性.本研究为开发新型基因工程疫苗佐剂和抗病毒制剂奠定了基础. 相似文献
222.
为了研制链球菌性奶牛乳房炎的有效疫苗,首先用PCR方法扩增出停乳链球菌的GapC基因。其次将GapC基因连接到pSC11穿梭质粒上,构建pSC11-GapC重组穿梭质粒。然后在脂质体的介导下将pSC11-GapC转染已感染痘苗病毒的BHK-21细胞,使之与痘苗病毒基因在BHK-21细胞内进行同源重组,得到GapC重组痘苗病毒,用rVV-GapC表示。最后用蓝斑法连续筛选5次rVV-GapC重组毒,再用PCR和Western blot分别检测rVV-GapC的重组和表达情况。结果显示,PCR电泳检测到目的条带,测序结果与GenBank公布的标准序列同源性99%,Western blot试验证明GapC蛋白在重组毒中进行了表达。rVV-GapC构建成功。重组痘苗病毒的构建为链球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究奠定基础。 相似文献
223.
224.
为研究靶向O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因shRNA转基因猪体细胞的抗病毒活性,本实验在成功培育转基因克隆猪的基础上,通过分离与培养转基因猪体细胞,对其shRNA进行PCR和Southern blot检测,并将FMDV感染体细胞中,通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光试验(IFA)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析转基因猪体细胞抗FMDV活性。结果表明,转基因猪体细胞基因组DNA中携带有靶向FMDV VP1基因的shRNA基因片段。与非转基因猪体细胞相比,接种FMDV转基因猪体细胞其出现CPE的时间延迟,细胞内病毒含量显著降低,细胞感染病毒36 h时,对细胞中FMDV VP1基因抑制效率为53.6%。表明该靶向FMDV shRNA转基因克隆猪体细胞在体外具有良好的抗病毒活性。本研究为进一步在体内评价转基因动物的抗病毒活性奠定了基础。 相似文献
225.
建立了绵羊(Ovis aries)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(GM-CSF)的EvaGreen Real-time PCR方法,具有较高的灵敏性(检测精度在10个拷贝数以内)和特异性(溶解曲线仅出现一个产物峰).绵羊GM-CSF在脂多糖(LPS)诱导前不表达,在诱导4 h后逐渐增加,在8 h达到最高(470 930拷贝数/ng总RNA),在诱导16 h之后表达水平逐渐降低.表明Real-timePCR是一种灵敏、可靠的检测绵羊GM-CSF表达的方法,GM-CSF参与早期的免疫应答反应. 相似文献
226.
针对O型12蹄疫病毒(Foot—and—mouth disease veirus,FMDV)基因组高度保守的VP1和3D区段,选取了120个干扰靶位,根据RNAi技术原理,构建了包括对照在内的82个shRNA表达质粒;通过细胞攻毒试验,提取细胞毒液RNA,然后RT-PCR,最后real—time PCR检测病毒和shRNA的表达量。结果显示,干扰质粒组基因表达抑制率为63%~96.8%,其中pSiRe—Zs—VP1—54和pSiRe-Zs-3D-12等2个表达质粒抑制效率最好,分别为96.8%和87%,表明这2个表达质粒能够明显抑制FMDV的复制。 相似文献
227.
为了重组表达乳房链球菌表面脱氢酶GAPC基因,为免疫学研究提供目标蛋白,用PCR方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出GAPC基因,用T/A克隆法将其插入PBST载体,并构建原核表达载体pET-32a(+)-GAPC。用BL21(DE3)/pET系统表达Trix-GAPC融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果表明,PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中乳房链球菌(AF421900.1)GAPC的基因序列同源性为99%。SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET-32a(+)-GAP总蛋白中出现一条分子质量为55ku的新蛋白带。Western blot分析显示,GAPC蛋白可与乳房链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。该研究已成功表达了GAPC,为GAPC在细菌致病中作用的研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。 相似文献
228.
229.
羊种布鲁氏菌的分离鉴定及其ugpB基因的原核表达 总被引:1,自引:1,他引:0
对新疆某羊场流产胎儿进行布鲁氏菌病原分离、培养,采用细菌群体形态观察、PCR、生化试验进行鉴定,结果分离得到了羊种布鲁氏菌生物3型,命名为027株.应用常规分子生物学方法克隆羊种布鲁氏菌生物3型027株的ugpB基因,构建原核表达载体pET-ugpB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白UgpB,进行SDS-PAGE和western blot分析,结果表明ugpB融合基因在大肠杆菌中得到了表达;采用Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得了纯化的融合蛋白. 相似文献
230.
为了解缺失SigmaB基因对单核细胞增生性李斯特菌(LM)的毒力影响。通过体外生长试验、巨噬细胞RAW264.7的粘附与侵袭试验、小鼠肝脾载菌量试验、毒力基因转录水平试验、小鼠LD50试验来研究缺失株(LM XS5 △SigmaB)的毒力变化。结果显示,与野毒株相比,缺失株体外生长能力减弱、侵袭率和粘附率降低,小鼠肝脾载菌量显著减少,毒力基因(inlA、inlB、hly、prfA、actA)的转录水平降低,而小鼠LD50升高。可见,SgmaB基因对LM的毒力具有重要的调控作用,为LM基因缺失疫苗和活疫苗载体的研发可资借鉴。 相似文献